合成生物学的关键技术及应用进展

20世纪的生物学研究一直着眼于对生物系统的不断分解,解剖至细胞中单个蛋白或基因,研究其结构和功能来解释生命现象。但随着当代分子生物学技术的迅猛发展,以系统化设计和工程化构建为理念的合成生物学成为新一代生物学的发展方向。     

大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体的构建及功能验证

目的构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达。方法从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合转移元件oriT、定点整合元件attp-int和安普霉素抗性基因Am的DNA片段替换其上的氯霉素抗性基因,该DNA片段通过PCR扩增得到,两端为待替换氯霉素抗性基因上下游55 bp的同源臂,替换后的载体通过酶切连入链霉菌组成型启动子ermEP1P2和绿色荧光蛋白（GFP）基因以验证其接合和整合功能。结果原载体pBeloBAC11的氯霉素抗性基因被成功替换,得到载体pBTIBAC1,利用该载体可在变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）TK24和1326中表达GFP,在pBTIBAC1上插入新的多克隆位点（MCS）后得到载体pBTIBAC11。结论 pBTIB AC11载体可通过接合转移携带外源基因片段进入链霉菌并整合至其基因组中,同时保留了原有BAC载体的功能元件,为大片段在链霉菌中的异源表达奠定了基础。     

合成生物学

合成生物学研究是个新兴而颇具前景的研究领域。该研究对多种天然的或人工设计的生物学元件进行了合理而系统的组合以获得重构的或非天然的“生物系统”。从解构到重构生命体、由破到立的认识方式转变。是对生物系统认识深入发展的必然结果。合成生物学研究就是连接这一过程的桥梁。本文对这一前沿领域的研究思路、近期主要研究成果及发展趋势做一概述。     

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

某制鞋企业化学有害因素的职业健康风险分析

目的 了解东莞市某制鞋企业化学有害因素产生的职业健康风险,为制鞋行业职业病危害防控提供科学依据。
方法 于2019年对东莞市某制鞋企业进行职业卫生调查、职业病危害因素检测,根据《工作场所化学有害因素职业健康风险评估技术导则》（GBZ/T 298-2017）采用半定量模型进行职业健康风险评估。
结果 该制鞋企业现有生产人员445人,实行每周工作6 d、每天11 h。该企业存在的17种化学有害因素中,丁酮、三氯乙烯、乙酸甲酯和乙酸乙酯存在超标情况。刷胶、擦拭、水印和补色4个岗位丁酮、二氯甲烷、环己酮、三氯甲烷、三氯乙烯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、正庚烷的健康损害风险等级为低风险;补色、刷胶、水印3个岗位丙酮的健康损害风险等级为低风险;擦拭岗位乙酸丁酯、甲醇的健康损害风险等级为低风险。其余物质对各岗位工作人员健康损害的风险等级为可忽略风险。酯类、卤代烃联合接触引起的健康风险等级高于苯系物。刷胶岗位酯类、卤代烃联合接触有中等健康风险,高于其他岗位。
结论 东莞市制鞋企业中化学有害因素可诱发潜在的职业健康风险,企业及职业卫生部门应采取有效的防控措施。
     

非霍奇金淋巴瘤的Rituximab治疗

Rituximab是用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单抗药物。Rituximab单独使用对B细胞NHL总有效率为40％～50％；和化疗药物联用有效率达90％以上。毒性作用轻微，是临床治疗B细胞NHL的安全有效的新药。现综述Rituximab用于治疗各种类型NHL的临床试验以及与其他药物联用的临床试验。     

Rituximab的作用机理与抗药机理

Rituximab是一种有效的治疗非霍奇金淋巴瘤的单抗药物,它定向作用于CD20抗原,主要通过ADCC、CDC和直接效应杀伤肿瘤细胞.绝大多数肿瘤细胞都对ADCC有一定程度的敏感性,其强度决定于Fc段的种类与Fc受体的类型.CDC可能是Rituximab在体内杀伤肿瘤的最主要机制,不同肿瘤细胞对于CDC的敏感性大不相同,并与Rituximab的临床疗效相关.CDC的强度受补体调节蛋白影响.Rituximab的直接效应主要是诱导凋亡等.Rituximab还通过致敏肿瘤细胞协助增强传统细胞毒性药物的疗效.细胞因子对改善Rituximab的疗效也有一定作用.肿瘤细胞对Rituximab的耐受现象广泛存在.这与细胞类型、肿瘤细胞所处的部位以及之前接受的治疗等多种因素有关.对于Rituximab的作用机理与抗药机理仍需更多研究.     

重组人肝再生增强因子对肝星状细胞基质分解素-1及其抑制因子基因表达的调节

肝再生增强因子(ALR)是Hagiya等[1]1994年从新生大鼠肝组织中克隆的一种理化性质与肝刺激物( HSS)相似的促肝细胞增殖因子.新近,我国学者克隆了大鼠ALR的人类同源分子[2],并通过构建原核表达载体,获高效表达菌株,进而获得重组hALR.初步研究表明hALR对四氯化碳中毒性及①免疫损伤性大鼠肝纤维化均有明显的防治作用[3、4].本文拟通过观察hALR对肝星状细胞基质分解素-1( MMP3 )及金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP1) 基因表达的影响,从细胞外基质降解代谢的角度探讨hALR抗肝纤维化的机制.     

筛选与KDR有结合活性的小肽

目的：从噬菌体12肽库和环7肽库中,筛选能够与KDR分子有特异结合活性的小肽。方法：以KDR/IgGFc为靶分子筛选噬菌体12和肽7肽库,经过3轮筛选和竞争性洗脱后,由ELISA、细胞-ELISA和竞争结合实验,鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：从40个噬菌体克隆中得到12个能特异性与靶分子结合的阳性克隆,其中,6个噬菌体克隆与靶分子有较强的结合力,6个结合力较弱。结论：测序结果表明,12条小肽的一级结构中没有发现共同模式。特异性与KDR结合的活性小肽,有望在临床上作为放化疗药物的导向肽,以提高药物的选择性和降低其毒副作用。     

大肠杆菌错配识别蛋白MutS的表达与活性鉴定

目的构建表达错配识别蛋白MutS,并进行错配识别活性鉴定。方法在大肠杆菌中表达MutS蛋白,并纯化获得目的蛋白;利用凝胶滞缓实验对错配识别活性进行验证,并计算MutS蛋白降低的错配率。结果纯化的MutS蛋白具有错配识别活性,并能降低DNA双链的错配率。结论表达纯化的MutS蛋白在体外具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性,从而有助于合成生物学的发展。