新型低基础表达Tet-on基因表达系统的构建与鉴定

目的:构建一种新型的具有更低基础表达的Tet-on调控系统,以用于毒性蛋白及 RNA病毒的真核细胞调控合成.方法:对目前常用的Tet-on系统中的四环素调控蛋白(rtTA、tTS)的表达途径进行改进,使得在非诱导条件下调控蛋白的基础诱导活性进一步降低.结果:相比原有的Tet-on系统,新构建的Tet-on系统非诱导状态下的基础表达值下降了一半以上.结论:成功构建基础表达值更低的Tet-on调控系统,为真核调控表达毒性蛋白或合成 RNA病毒打下了基础.     

炭疽毒素PA在E.coli中的表达、纯化及其生物活性分析

目的:构建pET-32a( )-PA重组质粒,实现融合蛋白Trx-PA在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的表达,并获得有生物学活性的PA.方法:采用PCR的方法扩增PA的编码序列,并且与pET-32a( )载体的Trx编码区融合产生pET-32a( )-PA重组质粒,将重组质粒转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达pET-32a( )-PA,通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析.利用Ni2 金属亲和层析纯化表达产物,通过梯度透析进行复性.通过蛋白酶降解和细胞毒性实验分析Trx-PA的生物学活性.结果:成功构建pET-32a( )-PA重组质粒,并纯化了Trx-PA融合蛋白.SDS-PAGE分析表明融合蛋白相对分子质量大小正确,经纯化复性后,蛋白纯度达到76%.Trx-PA在体内和体外均能被弗林蛋白酶(furin酶)降解.Trx-PA的正确降解是致死因子(lethal factor,LF)进入小鼠巨噬细胞Raw264.7内并产生细胞毒性的基础.结论:重组Trx-PA融合蛋白能在E.coli BL21(DE3)中有效表达,并表现出生物学活性.     

大肠杆菌O157∶H7新蛋白Ecs4563的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7新预测分子伴侣蛋白Ecs4563,以进一步开展其结构与功能的研究.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出分子伴侣基因ecs4563,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现诱导表达,采用Western印迹法进行鉴定,通过Ni2 螯合柱纯化获得目的蛋白.结果:构建了pET-24a-ecs4563重组质粒,实现了目的蛋白的融合表达,Ni2 金属螯合法纯化了目的蛋白,通过Western印迹法验证了融合蛋白的特异性.结论:得到了新预测分子伴侣Ecs4563,为下一步研究蛋白功能,进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

新预测的Ⅲ型分泌系统毒力蛋白Z3672的基因克隆、表达及纯化

目的：克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌EHEC O157：H7新预测毒力蛋白Z3672,以进一步开展其结构与功能的研究。方法：利用PCR方法从EHECO157：H7基因组中扩增出基因z3672,构建重组表达质粒,经测序证实后,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现诱导表达,采用质谱分析法和Western印迹试验进行鉴定,通过洗涤包涵体纯化目的蛋白。结果：构建了pET-24a-z3672重组质粒,经酶切及测序鉴定与预期序列一致,实现了目的蛋白的融合表达,并且对蛋白条带的质谱分析证实了表达蛋白即为Z3672蛋白。纯化后目的蛋白的纯度〉90％。结论：得到了新预测的毒力蛋白Z3672,为下一步研究蛋白功能,并进一步研究EHECO157：H7的致病机制奠定了基础。