新型低基础表达Tet-on基因表达系统的构建与鉴定

目的:构建一种新型的具有更低基础表达的Tet-on调控系统,以用于毒性蛋白及 RNA病毒的真核细胞调控合成.方法:对目前常用的Tet-on系统中的四环素调控蛋白(rtTA、tTS)的表达途径进行改进,使得在非诱导条件下调控蛋白的基础诱导活性进一步降低.结果:相比原有的Tet-on系统,新构建的Tet-on系统非诱导状态下的基础表达值下降了一半以上.结论:成功构建基础表达值更低的Tet-on调控系统,为真核调控表达毒性蛋白或合成 RNA病毒打下了基础.     

用Red系统敲除大肠杆菌O157:H7的ecs4553以及ecs4563基因

目的:用Red系统快速敲除肠出血性大肠杆菌O157:H7中的分子伴侣基因,构建EHEC O157:H7的突变体.方法:本研究首先合成一对引物(每一条的5'端与ecs4553或者ecs4563基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源),用pKD4为模板扩增出带有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化至大肠杆菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的ecs4553或者ecs4563基因序列在体内与ecs4553或者ecs4563基因发生同源重组,置换掉基因组中的ecs4553或者ecs4563基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因剔除.结果:获得了ecs4553或者ecs4563基因被精确敲除且不带卡那霉素抗性基因的EHEC O157:H7突变菌株.结论:为进一步研究EHEC O157:H7的致病机制奠定了基础.     

Toll样受体5基因多态性与中国人群脓毒症的相关性研究

目的 探讨Toll样受体5(Toll-like receptor 5, TLR5)基因多态性位点与脓毒症发生风险及疾病严重程度的相关性.方法 采用病例-对照研究设计,募集了255例脓毒症患者和260例对照个体.应用贝克曼公司的商用SNPstream 分型技术和PCR-RFLP 方法对TLR5基因的3个编码区多态性位点进行分型.采用Logistic 回归分析,校正性别、年龄、吸烟和饮酒、慢性病状态、APACHEⅡ评分和脓毒症病因等混杂因素的影响,评价多态性位点与脓毒症的发生风险,以及脓毒症性休克、死亡和器官功能障碍等表型的遗传相关性.结果 TLR5基因的3个多态性位点在病例和对照组中的基因型分布均呈哈-温平衡状态.这3个编码区的多态性位点与脓毒症的发生风险和疾病严重程度均无遗传学关联.结论 TLR5基因的多态性位点可能在脓毒症的发生、发展和病程转归中不发挥重要作用.     

抗CD19 CAR-T对K562~(CD19+)肿瘤细胞特异性杀伤作用的研究

目的构建表达抗CD19分子的嵌合抗原受体,制备抗CD19 CAR-T细胞,研究其对CD19表型细胞的特异性识别和杀伤效果。方法通过分子克隆方法,构建能够自剪切EGFP荧光报告的抗CD19 CAR分子,将其重组到慢病毒载体中并包装获得慢病毒。通过慢病毒递送的方式,将抗CD19 CAR过表达于primary-T细胞,流式细胞术分析确认表达后,通过ELISA检测CAR-T细胞IL-2分泌情况,最后用LDH释放法评价靶向杀伤作用。结果成功获得抗CD19 CAR的慢病毒递送载体;流式细胞术表明CAR分子在T细胞表面高效稳定表达;ELISA结果显示CAR-T细胞在靶细胞刺激下IL-2分泌水平显著升高(P0.01);LDH结果显示CAR-T细胞特异性杀伤CD19表型细胞,且杀伤效果在E:T=10:1时达到50%以上,显著高于对照组(P0.05)。结论成功获取了具有靶向CD19表型细胞的CAR-T细胞,能高效特异性杀伤肿瘤细胞。     

ERRα通过抑制TBK1活性抑制干扰素途径

目的本文拟证明TANK结合激酶1（TBK1）与雌激素受体相关受体α（ERRα）的相互作用及ERRα对TBK1活性的影响。方法通过免疫共沉淀（co-IP）方法证明TBK1与ERRα是否可以在体内外形成复合物,然后通过荧光素酶报道基因的方法研究ERRα对β干扰素（IFNβ）信号通路的影响,再用小干扰RNA构建了ERRα敲低稳定细胞系,在该细胞系中进一步检测ERRα对IFNβ信号通路的影响。结果通过内源及外源co-IP发现,TBK1与ERRα可以发生相互作用;另外,ERRα可抑制VSV病毒、polyI∶C及TBK1引起的IFNβ升高,敲低ERRα表达后,IFNβ表达水平增加。结论 TBK1与ERRα在293细胞内可以发生相互作用,ERRα抑制IFNβ途径的激活,为进一步研究ERRα在宿主先天免疫中的作用奠定了基础。     

肿瘤坏死因子受体相关因子6基因多态性与脓毒症易感性研究

目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因多态性位点与脓毒症发生风险及疾病严重程度的关联性.方法 采用HapMap单倍型标签SNPs(htSNPs)策略和SNPstream分型方法,对255例脓毒症患者和260例对照个体进行分型.采用Logistic回归分析,校正性别、年龄、吸烟、饮酒、慢性病状态、APACHEⅡ评分和脓毒症病因等混杂因素,评价TRAF6多态性位点与脓毒症的发生风险,以及脓毒症性休克、死亡和器官功能障碍的遗传相关性.结果 TRAF6基因在中国人群中共捕获7个htSNPs.rs5030490,rs5030411,rs5030416,rs5030445和rs3740961最终用于分型研究.5个htSNPs位点在病例和对照组中的基因型分布均呈哈-温平衡状态.TRAF6多态性位点与脓毒症的发生风险和疾病严重程度均无明显相关性.结论 在中国人群中,TRAF6基因多态性位点在脓毒症的发生、发展和病程转归中可能不发挥重要作用.     

大肠杆菌O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体的构建

目的：构建EHEC O157∶H7 EDL933wz3672基因缺失突变体。方法：根据已知的O157∶H7 EDL933基因组全序列,采用pKOBEG介导的Red重组系统,筛选卡那霉素抗性基因替换z3672基因的阳性克隆,然后FLP位点特异性重组去除两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因,最后通过PCR和测序手段证实。结果：获得了z3672基因缺失而且不含有卡那霉素抗性基因的EHEC O157∶H7 EDL933w突变菌株。结论：为进一步研究O157∶H7的致病机制奠定了基础。     

CAR在乳鼠肠、肝、心、脑、肾、肺组织的表达

目的检测柯萨奇-腺病毒受体(CAR)在乳鼠肠、肝、心、脑、肾、肺组织中的表达变化,为研究CVB感染引发病毒性疾病与组织中CAR表达水平的关联性提供参考。方法采用荧光实时定量PCR和Western blot法测定正常BALB/c乳鼠肠、肝、心、脑、肾、肺组织中CAR受体在核酸水平和蛋白水平的相对表达量。结果定量PCR显示CAR在乳鼠脑、肺、肠组织中表达显著高于肝、肾、心组织,差异均有显著性(P<0.01)。Western blot检测发现与定量PCR结果基本一致。结论 CAR的表达存在组织特异分布的特点。     

肿瘤转移关键酶:人乙酰肝素酶氨基端亚基的表达纯化及鉴定

目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移的过程中起重要作用,其氨基端小亚基蛋白(Mr为8×103)对其功能活性是不可缺少的。得到此蛋白将有助于深入研究乙酰肝素酶的功能活性。方法:我们从人胎盘cDNA文库中分离乙酰肝素酶蛋白全长编码基因,将乙酰肝素酶氨基端小亚基的基因克隆入pGE-X2TK,转化大肠杆菌进行融合表达。经发酵,纯化,复性得到乙酰肝素酶的氨基端亚基蛋白。结果:得到6.9g纯度>90%的氨基端小亚基融合蛋白。GSTpull-down实验表明,此融合蛋白可与乙酰肝素酶羧基端大亚基蛋白结合。复性后的融合蛋白可被激酶切割为GST蛋白和乙酰肝素酶氨基端亚基蛋白。结论:所得的乙酰肝素酶的氨基端小亚基蛋白为进一步研究该亚基蛋白在细胞内的免疫亚定位及功能奠定了基础。