小鼠胚胎干细胞凝血因子IX基因的定向敲除

目的:将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ(mFⅨ)基因定向敲除,为建立血友病B的转基因小鼠模型奠定基础;摸索建立ES细胞基因打靶技术体系.方法:将线性化的针对小鼠mFⅨ基因组的基因打靶置换型载体(pMFⅨDEL)DNA用电穿孔法转入小鼠ES细胞,经过G418和GANC分组药物选择,用PCR和基因组Southern杂交两种方法,鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况.结果:(1)从药物抗性细胞克隆中鉴定获得了4个发生了按所设计的方式进行了同源重组的ES细胞克隆;(2)观察到在Es细胞中,pMFⅨDEL载体DNA与内源mFⅨ基因发生同源重组的频率平均为1.67×10-6.结论:得到了4个mFⅨ基因已被敲除的ES细胞克隆;建立了ES细胞基因打靶的技术体系.     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

小鼠神经细胞p35nck5a基因 5′非编码区基因表达调控功能初步研究

目的:观察阿尔茨海默病(AD)的相关基因p35nck5a 基因5′侧翼区指导报告基因表达的能力.方法:将对本实验室所克隆的p35nck5a基因5′侧翼片段连接于报告基因β-半乳糖苷酶基因的上游构建表达载体,利用体外培养细胞和转基因小鼠实验体系来观察该片段在体内、外基因表达调控的差异.结果:体外培养细胞中p35nck5a基因5′侧翼序列不具有决定报告基因神经特异性表达的能力,但在基因组中整合有相同表达载体的转基因小鼠体内却能够指导报告基因的神经限制性表达.结论:这种差异提示进行体内、外研究是揭示基因的组织特异性表达分子机制的必要手段.     

DNA修复:医学遗传学的新领域

DNA修复是核酸代谢研究的一个重要领域,它广泛地涉及到生命科学的许多学科,在基础理论和实践应用方面都有相当重要的意义。早在1949年,Kelner就描述了DNA修复现象~1,随着DNA结构的发现及其研究的不断深入,通过对原核细胞、低等     

小鼠受精卵显微操作方法的改进

目的：改进小鼠受精卵显微操作方法，提高小鼠受精卵的存活率、假孕母鼠生产率及得仔率。方法：以一定长度大小及浓度的DNA片段为材料，分别进行常规及改进的显微操作后，统计分析受精卵存活率、假孕母鼠生产率及得仔率。结果：经改进后缩短操作时间的显微操作法与常规显微操作法相比，小鼠受精卵的存活率由60．3％提高至79．5％、假孕母鼠生产率由35．7％提高至56．8％、得仔率由10．1％提高至14．1％，均有显著差别（P＜0．01）。结论：改进的显微操作法可推广应用于常规的转基因小鼠制备。     

乙型肝炎转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.0)SMMU的生物学特征

目的：评价乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU生物学特征的稳定性。方法：以F6代乙肝转基因小鼠C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU为研究对象，采用基因组DNA PCR，血清ELISA检测，Western印迹分析，免疫组织化学，血清DNA PCR，透射电镜和H－E染色的方法分析HBV基因在转基因小鼠中的整合，表达，复制和组织这变化。结果：F6代乙肝转基因小鼠基因组中稳定整合有HBV基因，肝组织中可检测用HBsAg,HBcAg和X蛋白3种病毒蛋白，血清中HBsAg和HBeAg的表达率分别为19．54％和3．39％，且在血清和肝组织中存在病毒NA和病毒样颗粒；长期的病毒DNA整合，表达和复制可以引起转基因小鼠肝，肺等组织的病理性损伤。结论：乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU具有基因组中稳定整合病毒DNA，血清和肝组织中有病毒蛋白表达和病毒复制的特征，并具有一定的组织这变化，作为生物医药研究的实验动物模型具有推广应用价值。     

乙肝病毒X蛋白诱导HeLa细胞和转基因小鼠肝细胞凋亡的研究

背景与目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白在细胞凋亡中的作用.材料与方法:采用基因重组技术构建乙型肝炎病毒x基因的真核表达载体pcDNA3-HBx.脂质体FuGENE6转染HeLa细胞,并用蛋白印迹检测pcDNA3-HBx在HeLa细胞中的表达.流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:成功构建了可在真核细胞中稳定表达X蛋白的HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx.稳定转染pcDNA3-HBxDNA的HeLa-Xs细胞的凋亡率为9.8%,较空白HeLa细胞的凋亡率(0.4%)以及对照细胞HeLa-Vs细胞的凋亡率(1.3%)高;两只转基因小鼠肝细胞的细胞凋亡率分别为54.4%和40.4%,较正常小鼠肝细胞的细胞凋亡率(6.8%)明显增高.结论:X蛋白可在体外和体内诱导细胞凋亡.     

癌干细胞的研究现状

1 癌干细胞理论 肿瘤是危害人类健康的一大顽症。在发生机理方面，影响力比较大的假说主要有：基因突变假说、非整倍体假说以及表遗传改变假说。这是因为肿瘤细胞中总是存在着基因突变、染色体结构和数目改变以及表遗传改变等。但是。不论哪种假说都不能完全解释有关肿瘤的所有现象。癌干细胞假说最早是在20世纪70—80年代提出的。该假说认为：肿瘤组织与正常组织一样，是由处于各种分化等级的细胞组成的。其中。有一种在数量上占少数的干细胞样细胞，它具有无限的增殖能力和分化潜能，是肿瘤形成的起始细胞。它能够通过分裂产生大量的增殖能力有限的其它肿瘤细胞以及增加自身细胞的数量，所以，它在肿瘤的发生、恶化、转移中起重要作用。     

MafA逆转录病毒表达载体的构建及其在肝原始细胞中的稳定表达

目的:构建表达MafA(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homologue A)的逆转录病毒表达载体,并建立稳定表达MafA的肝原始细胞系(liver epithelial progenitor cells,LEPCs).方法:通过PCR方法克隆MafA基因全长,将其构建到pBMN-Z-IRES-Neo逆转录病毒载体中获得pBMN-MafA-Neo载体;将该载体导入Phoenix包装细胞系,收集病毒上清并感染LEPCs,筛选稳定表达MafA的LEPCs;RT-PCR方法检测MafA表达对LEPCs分子表型的影响.结果:成功构建pBMN-MafA-Neo载体,并获得稳定表达MafA基因的肝原始细胞系(LEPCs-MafA).LEPCs-MafA细胞GK和GLUT2基因表达高于LEPCs.结论:成功获得稳定表达MafA的肝原始细胞系,为研究MafA诱导肝干细胞向胰腺细胞转分化奠定了基础.