乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的：分析乙型肝炎病毒preS2蛋白在3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法：采用原核显微注射法将质粒pcDNA3.1-preS/S^t注射入小鼠受精卵雄原核，制备转基因小鼠。PCR法在基因组小平筛选3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠首建者（founder）及后代；免疫组织化学法在蛋白水平检测preS2蛋白在这些小鼠中的表达；H－E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果：以原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，共出生15只新生小鼠，其中存活7只，经PCR检测后获得2只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(preS/S^t）SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有preS2蛋白表达，H－E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F2代。结论：本研究成功建立了稳定遗传3’末端缺失的preS/S基因并表达preS2蛋白的转基因小鼠C57－TgN(preS/S^t)SMMU，它将是体内研究3’末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间关系的理想动物模型。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

乙型肝炎转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.0)SMMU的生物学特征

目的：评价乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU生物学特征的稳定性。方法：以F6代乙肝转基因小鼠C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU为研究对象，采用基因组DNA PCR，血清ELISA检测，Western印迹分析，免疫组织化学，血清DNA PCR，透射电镜和H－E染色的方法分析HBV基因在转基因小鼠中的整合，表达，复制和组织这变化。结果：F6代乙肝转基因小鼠基因组中稳定整合有HBV基因，肝组织中可检测用HBsAg,HBcAg和X蛋白3种病毒蛋白，血清中HBsAg和HBeAg的表达率分别为19．54％和3．39％，且在血清和肝组织中存在病毒NA和病毒样颗粒；长期的病毒DNA整合，表达和复制可以引起转基因小鼠肝，肺等组织的病理性损伤。结论：乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU具有基因组中稳定整合病毒DNA，血清和肝组织中有病毒蛋白表达和病毒复制的特征，并具有一定的组织这变化，作为生物医药研究的实验动物模型具有推广应用价值。     

HBV转基因在C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU3小鼠基因组中的整合分析

目的:分析HBV转基因在乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系基因组中的整合特征.方法:以F6～F17代乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU为研究对象,采用基因组DNA PCR、Southern印迹和DNA测序的方法,分析HBV转基因在该品系转基因小鼠基因组中的整合特征.结果:PCR分析显示,F6～F17代乙肝转基因小鼠基因组中均已稳定整合了相同拷贝数的HBV转基因,整合的HBV DNA可通过生殖系在世代间稳定遗传.整合在转基因小鼠基因组中的HBV DNA含有HBVpres、s、c、x基因,Southern印迹证实HBV转基因含有全长HBV基因组DNA,DNA测序结果表明,该品系转基因小鼠所整合的转基因为adr亚型的HBV DNA.结论:C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系转基因小鼠基因组中均整合有adr亚型的全长HBV基因组DNA,从DNA水平证实该转基因小鼠品系已具备了乙肝实验动物模型的基本条件.     

一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.     

HBV病毒蛋白在C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU小鼠中的表达

目的:分析C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系转基因小鼠血清和组织中病毒蛋白的表达及其特征.方法:以138只F6～F17代C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系的转基因小鼠为研究对象,采用血清ELISA检测和免疫组织化学的方法分析病毒蛋白在转基因小鼠中的表达.结果:转基因小鼠血清中HBsAg和HBeAg的阳性率分别为55.18%和25.00%,血清中HBsAg的出现时间多在3个月龄之前(占93.33%),且持续时间在9个月以上(占95.56%),个体之间具有一定差异.转基因小鼠肝组织中至少可检测到一种病毒蛋白,HBsAg、HBcAg和X蛋白的检出率分别为85.82%、58.24%和49.61%.HBsAg分布于肝细胞质中,HBcAg和X蛋白既可分布于肝细胞核中,也可分布干肝细胞质中.HBsAg的表达具有细胞特异性(门管区周围的肝细胞)和组织特异性(肝和肾),X蛋白除在肝脏和肾脏中表达外,还可在脑组织中表达.结论:C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系转基因小鼠血清和肝肾等组织中有病毒蛋白的表达,病毒蛋白的分布具有组织细胞特异性和个体差异.     

转绿色荧光蛋白基因小鼠子宫内膜异位症模型的建立和评价

目的建立小鼠子宫内膜异位症种植模型,探讨荧光检测异位子宫内膜的方法。方法将转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠的子宫内膜剪碎后,注射入C57BL/6小鼠的腹腔,喂养含17-β-雌二醇的无菌水,3周后剖检小鼠,在活体荧光成像系统下观察腹腔的绿色荧光,并做免疫组化染色。结果在移植转GFP基因小鼠子宫内膜的C57/BLC57BL/6小鼠的腹腔内存在绿色荧光,且免疫组化证实该异位内膜组织中表达GFP,而对照组均阴性。结论转GFP基因小鼠子宫内膜模型可清晰地显示异位内膜病灶,具有良好的应用前景。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的 将人的钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin,CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法 利用Gateway技术构建pRP.EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57BL/6J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果 将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100%,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9%。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论 通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

异种肝移植模型-转入CD59蛋白基因小鼠的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59 cDNA的启动子．CMV作为报告基因GFP的启动子．构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV-GFP-OMT-CD59基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性．进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59 cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠。可用于进一步异种移植研究。     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的 研究曲线精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法 选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白（pCMV－EGFP）表达载体，应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质料DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右，雄鼠与雌鼠合笼交配；分娩后3周，剪取仔鼠尾，提取基因组DNA，应用PCR、Southern blotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠，荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果 共注射41只雄性小鼠，存活34只，其中32只具有交配、受精能力，获得仔鼠382只。仔鼠经检测，PCR阳性133只，织冰冻切片中EGFP明显表达。结论 曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU小鼠血清和肝组织中HBsAg的表达模式分析

目的:分析C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系转基因小鼠的月龄、性别和遗传背景与其血清和肝组织中HBsAg表达模式的关系.方法:采用血清ELISA检测和免疫组织化学的方法检测转基因小鼠血清和肝组织中HBsAg的表达,统计学方法分析转基因小鼠血清和肝组织中HBsAg的表达与小鼠的月龄、性别、遗传背景的相关性.结果:转基因小鼠在出生后1～3个月时,血清中HBsAg的表达较低或甚至不表达,8个月龄左右时最高,此后逐渐降低,但肝组织中HBsAg的表达相对稳定在较高水平,能真实反映转基因小鼠中HBsAg的表达.雄性小鼠血清和肝组织中HBsAg的表达量高于雌性小鼠(P＜0.05).转基因小鼠与C57BL/6品系、DAB品系和129s品系正常小鼠交配后的子代,其血清和肝组织中HBsAg表达量均未发生变化.血清阳性的小鼠中肝组织HBsAg阳性率为94.05%,两者呈正相关关系(r=0.257,P＜0.01).结论:C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系转基因小鼠血清和肝组织中HBsAg的表达具有发育调节和性别差异.     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU转基因小鼠肝脏的组织病理学观察

目的:研究乙型肝炎转基因小鼠品系C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU肝脏的组织学及免疫病理学特征.方法:以168只SPF级乙肝转基因小鼠及15只正常C57BL/6小鼠为研究对象,取肝组织连续切片,常规H-E染色,并选取20例有明显单个核细胞肝内浸润的肝标本,免疫组化原位鉴定白细胞分化抗原的肝内分布.结果:37.5%的转基因小鼠肝脏出现人慢性轻度乙型肝炎样的病理改变,病变率随月龄增大显著增高;32.7%有更轻微的非特异性炎症反应;肝内浸润的单个核细胞多数为CD3 、CD4 细胞,未发现CD57 、CD8 细胞浸润.结论:乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU肝脏可出现不同程度的病理改变,与人慢性轻度乙肝组织学相类似.     

乙肝全基因组转基因小鼠肝组织病理及部分免疫学特征

目的:研究C57-TgN(HBVadr2.0) SMMU“3号”品系乙型肝炎转基因小鼠肝脏的组织病理学及部分免疫学特征.方法:通过对130例SPF级乙型肝炎转基因小鼠和30例同龄正常C57BL/6小鼠肝组织进行免疫组织化学染色、HE染色和浸银染色分析,研究转基因小鼠HBsAg的表达以及病理改变情况.选取15例肝组织有单个核细胞浸润的转基因小鼠检测白细胞分化抗原的表达情况.结果:60.77％(79/130)的转基因小鼠肝脏组织中出现了不同程度的肝组织病理性改变,包括肝细胞变性、单个核细胞浸润和纤维组织增生,且与月龄正相关,而与性别、病毒蛋白的表达无相关性.选取出现单个核细胞浸润的肝组织进行免疫组织化学检测发现,肝组织中浸润的单个核细胞大多为CD3+、CD4+T细胞.结论:C57-TgN (HBVadr2.0) SMMU“3号”品系乙肝全基因组转基因小鼠肝脏产生类似慢性无症状HBV携带者的病理学变化,病理改变与病毒蛋白表达无相关性,与小鼠月龄呈正相关性.     

异种肝移植模型-转人CD59蛋白基因小鼠的建立

目的　通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD5 9蛋白的转基因小鼠模型。方法　实验中利用OMT作为目的基因hCD5 9cDNA的启动子 ,CMV作为报告基因GFP的启动子 ,构建重组质粒 pGOC。通过显微注射法 ,把CMV GFP OMT CD5 9基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果　产生出 86只F0 代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测 ,12只阳性 ,进一步用Southernblot法检测 1只阳性。结论　通过显微注射法 ,外源基因hCD5 9cDNA在小鼠基因组中得到整合 ,产生出了阳性转人CD5 9蛋白基因小鼠 ,可用于进一步异种移植研究     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。