人hTRT正反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）正、反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术将ｈＴＲＴ ｃＤＮＡ正向及反向克隆到真核表达载体ｐｃｌ－ｎｅｏ中。结果 Ｎｏｔ Ⅰ酶切后,正义重组基因为８．８ｋｂ一条带,反义重组基因为３．４ｋｂ和５．４ｋｂ二条带,与理论计算相符。结论 成功构建了ｈＴＲＴ正反义真核表达载体。     

胃癌组织幽门螺杆菌感染与微卫星不稳定性研究

通过分析胃癌组织幽门螺杆菌感染与微卫星ＤＮＡ不稳定性（ＭＳＩ）的关系,探讨幽门螺杆菌与胃癌发生中的作用。方法：采用ＰＣＲ为基础的方法对４９例胃癌组织Ｈｐ尿素酶酶和Ｂ基因以及６个微卫星位点（Ｄ１７ｓ２６１,Ｄ１７ｓ７９９,ＴＣＦ－２,Ｄ１８ｓ３４,Ｄ５ｓ４０９和Ｄ５ｓ４０９和Ｄ５ｓ８２）进行检测,对Ｈｐ感染与微卫星不稳定性间的关系进行分析,结果胃癌组织ＨｐＤＮＡ的检出率为４０．８％（２０／４９）,其     

食管癌APC／MCC,DCC的基因杂合丢失的研究

目的 研究ＡＰＣａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）,ＭＣＣ（ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ和ＤＣＣ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｒ）基因在人食管癌组织中的变化。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及限制性片段长度多态现象（ＲＦＬＰ）法检测了４６例食管癌组织中ＡＰＣ、ＭＣＣ和ＤＣＣ基因的杂合缺失。结果 ＡＰＣ、ＭＣＣ和ＤＣＣ位点的杂     

全反式维甲酸诱导对胃癌细胞株端粒酶活性的影响

端粒酶（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）是近年来发现的人体内唯一由ＲＮＡ和蛋白质组成的具有逆转录酶活性的核糖核蛋白酶（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）。在正常人体细胞中端粒酶一般不表达或活性极低,而在肿瘤组织中则明显增高,肿瘤组织中端粒酶的活化可以维持染色体端粒长度的动态平衡,因此,端粒酶活化作为肿瘤细胞无限制增殖的一个重要条件有可能是肿瘤发生过程中的一条必经通路［１］。维甲酸具有逆转肿瘤细胞的作用。本研究以维甲酸体外诱导的ＳＧＣ－７９０１细胞为模型,研究诱导后肿瘤细胞端粒酶活性的变化,并拟从端粒酶亚…     

反义hTRT转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因转染对SGC－7901胃癌细胞株形态学的影响;方法 采用脂质体法将hTRT正、反义真核表达载体导入SGC－7901胃癌细胞株中,从光镜、电镜水平观察转染细胞形态学的变化。结果 与未转染细胞相比,光镜下hTRT反义基因转染的SGC－7901胞体增大,胞浆丰富,分裂相减少,核浆比增大,异型性减小;透射电镜下反义基因转染细胞细胞器丰富,胞浆内出现分泌泡样结构及胞质内微囊;扫描电镜下反义基因转染细胞表面微绒毛增多,胞体周围可见大量颗粒样物质,根据AB／PAS染色结果,这些颗粒样物质有可能是其分泌的粘液颗粒。结论 hTRT反义基因有促进SGC－7901细胞分化的作用。     

小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建

目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。     

大肠癌组织APC/MCC基因杂合的缺失

目的研究大肠癌ＡＰＣ／ＭＣＣ基因杂合缺失的作用。方法采用ＰＣＲ技术，并配合限制性片段长度多态现象（ＲＦＬＰ）分析，对４１例外科手术切除大肠癌组织ＡＰＣ／ＭＣＣ基因杂合缺失（ＬＯＨ）进行检测。结果在大肠癌４１例中ＡＰＣ基因属信息个体者２５例，检出ＬＯＨ７例，占２８．０％；ＭＣＣ基因属信息个体者２２例，检出ＬＯＨ８例，占３６．４％。若将ＡＰＣ和ＭＣＣ基因进行综合分析，则信息个体者３６例，检出ＬＯＨ１４例，占３８．９％。ＡＰＣ和ＭＣＣ基因的ＬＯＨ与肿瘤大小、组织学类型、浆膜浸润、淋巴结转移及Ｄｕｋｅｓ分期无关（Ｐ＞０．０５）。结论ＡＰＣ和ＭＣＣ基因ＬＯＨ是大肠癌的常见改变     

糖尿病足患者感染严重程度与炎性因子水平的相关性分析

目的探讨糖尿病足患者感染严重程度与炎性因子水平的相关性。方法190例糖尿病足患者,按照是否发生感染分为未感染组(110例)和感染组(80例),感染组再根据糖尿病足的Wagner分级分为轻度感染组(28例)、中度感染组(32例)、重度感染组(20例),另选取同期本院健康体检者60例作为健康组。比较未感染组、感染组、健康组受检者的炎性因子[白细胞介素-6(IL-6)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、降钙素原(PCT)]水平及感染组不同感染程度患者的炎性因子(IL-6、hs-CRP、TNF-α、PCT)水平,分析糖尿病足感染程度与炎性因子的相关性。结果感染组、未感染组、健康组受检者的IL-6、hs-CRP、TNF-α、PCT水平比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。感染组和未感染组的IL-6、hs-CRP、TNF-α、PCT水平均高于健康组,感染组的IL-6、hs-CRP、TNF-α、PCT水平均高于未感染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。感染组不同感染程度患者的IL-6、hs-CRP、TNF-α、PCT水平比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。重度感染组IL-6(155.19±19.05)mg/ml、hs-CRP(60.08±6.17)mg/L、TNF-α(26.51±4.11)ng/ml、PCT(6.25±1.42)μg/ml和中度感染组的IL-6(135.38±17.52)mg/ml、hs-CRP(42.57±5.00)mg/L、TNF-α(22.49±3.59)ng/ml、PCT(3.58±1.21)μg/ml均高于轻度感染组的(124.97±13.27)mg/ml、(25.93±3.44)mg/L、(20.07±2.63)ng/ml、(1.20±0.81)μg/ml,重度感染组的IL-6、hs-CRP、TNF-α、PCT水平均高于中度感染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。糖尿病足患者血清IL-6、hs-CRP、PCT、TNF-α水平与感染程度均呈正相关(r=0.410、0.620、0.518、0.502,P<0.05)。结论糖尿病足患者血清IL-6、hs-CRP、TNF-α、PCT水平和感染程度具有正相关性,其可作为对糖尿病足感染的早期诊断指标。     

小鼠Islet-1基因慢病毒表达载体的构建及其诱导C_3H_(10)T1/2细胞向心肌样细胞特异性分化

目的研究Islet-1对干细胞分化的影响。方法用PCR钓取目的基因,将目的基因与pLenO-WPI载体连接,选取阳性质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞生产出慢病毒载体。感染C3H10T1/2细胞,实时荧光定量PCR及Western blot检测Islet-1和心肌、肝脏、骨骼及神经各系统相关标志物的表达,免疫荧光检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达部位。结果 PCR及测序显示目的片段正确插入,实验组有Islet-1表达;心肌早期发育相关基因GATA-4、MEF2C、NKx2.5在检测到荧光蛋白1周后升高,2周到达高峰,3周后可检测到心肌特异性蛋白cTnT(0.582±0.0576),其时序性表达呈随时间增强趋势;cTnT表达于胞质;肝脏系统特异性标志AFP及ALB、骨骼系统特异性标志BGP及BALP、神经系统特异性标志Nestin及GFAP均未表达。结论 Islet-1具有特异性促进干细胞向心肌样细胞分化的作用。     

体外模拟肿瘤微环境中致大鼠MSCs瘤化因子分析

 目的 探讨模拟肿瘤微环境中骨髓间充质干细胞（MSCs）肿瘤转化的发生与HGF、IL-6、BFGF关系。方法 实验组为C6胶质瘤与MSCs间接共培养模拟肿瘤微环境下MSCs的生长,对照组为星型胶质细胞与MSCs间接共培养模拟正常微环境下MSCs的生长,空白对照组MSCs单独培养;QPCR,免疫荧光检测各组的P53和MDM2的基因和蛋白的表达;ELISA检测各组HGF、IL-6、BFGF的表达;免疫荧光检测对应升高的细胞因子作用于MSCs后的STAT3蛋白的表达。结果 实验组的MSCs形态肿瘤化;MSCs的MDM2 mRNA是对照组的1.56±0.21(P<0.05),MDM2蛋白表达率比对照组升高90±7%(P<0.01);MSCs的P53的mRNA表达是对照组的0.55±0.10, 而P53突变蛋白表达率比对照组升高87±5%(P<0.01);HGF、IL-6水平比对照组中达水平升高(P<0.05);过量IL-6处理组的MSCs的STAT3激活蛋白表达率比正常量IL-6处理组明显升高(P<0.01)。结论 IL-6参与MSCs在肿瘤微环境下的肿瘤转化的发生。