SP110基因过表达慢病毒载体的构建与包装

目的 构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法 利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用RNAi-Mate将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)包装成重组慢病毒颗粒,共转染293T细胞,包装产生慢病毒。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞,结合稀释倍数计算病毒滴度。结果 酶切鉴定结果显示产生约1 650 bp的片段,片段大小与SP110基因cDNA大小一致。DNA测序比对测序结果与预期SP110基因序列完全一致,说明SP110基因正确插入载体中,成功构建了SP110基因过表达载体。经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为1.0×108 TU/mL的重组慢病毒LV5-SP110。结论 SP110基因过表达慢病毒载体构建与包装成功完成,为进一步探讨SP110基因在结核病发生发展中的作用提供工具。     

TK基因慢病毒载体质粒的构建及慢病毒表达系统的建立

目的:构建人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的慢病毒载体质粒,并建立其慢病毒表达系统.方法:利用酶切分别获取目的基因TK片段及慢病毒pLenti6/V5载体片段,将目的基因插入载体相应酶切位点,构建pLenti6/V5-TK质粒.构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定.利用慢病毒表达系统(ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pLP1,pLP2,pLP/VSVG) 4质粒共转染293T细胞,48 h后收集培养上清并感染大鼠胶质瘤细胞9L,抗稻瘟菌素(blasticidin, BSD)筛选9L/TK细胞.MTT方法测试更昔洛韦(ganciclovir GCV)对体外培养的9L/TK细胞杀伤效果.结果与结论:构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7×105转导单位(transducing units,TU)/ml.经BDS筛选的9L/TK细胞对GCV杀伤敏感.成功构建了TK基因慢病毒载体质粒pLenti6/V5-TK,并建立了其慢病毒表达系统.     

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Slc35c1敲除细胞株及其抗蓖麻毒素效应研究

目的 构建稳定敲除小鼠Slc35c1基因的单克隆细胞株,为研究Slc35c1基因抗蓖麻毒素毒性效应奠定实验基础.方法 根据Slc35c1基因序列设计2对sgRNA插入载体lentiCRISPRv2中,构建lentiCRISPRv2-sgRNA质粒;慢病毒包装并感染NIH/3T3细胞,加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;T7E1酶切鉴定sgRNA切割效率;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行RT-qPCR检测及基因组PCR产物测序,确认Slc35c1敲除成功的细胞株;最后通过CCK-8试剂检测蓖麻毒素对野生型和Slc35c1敲除细胞对的抗毒效应差异.结果 测序结果显示sgRNA成功插入载体质粒中,T7E1酶切结果表明两对sgRNA均可高效切割基因组DNA.RT-qPCR及基因组PCR产物测序鉴定出Slc35c1敲除的纯合子细胞株.CCK-8实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除Slc35c1使毒素作用NIH/3T3细胞24 h的IC50值由0.45×10-10 mol/L升至2.1×10-10 mol/L.结论 利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除了NIH/3T3细胞中的Slc35c1基因并筛选获得纯合子细胞株,该细胞株可用于抗蓖麻毒素效应的研究.     

人THAP11基因RNAi慢病毒表达系统的建立

目的构建人THAP11基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,制备高滴度病毒颗粒,敲低K562细胞和脐带血CD34＋细胞中THAP11表达。方法采用第三代慢病毒包装系统,将含有特异性干涉THAP11的DNA序列克隆入穿梭质粒pSicoR中,构建siTHAP11-pSicoR质粒。在脂质体介导下,siTHAP11-pSicoR与包装质粒pLP1,pLP2,pLP/VSVG共转染HEK293T细胞,获得高滴度慢病毒颗粒。感染K562细胞,检测内源THAP11敲低效果。感染人CD34＋细胞,流式分选GFP阳性细胞,检测原代细胞中THAP11的敲低效果。结果成功构建针对THAP11两个位点的RNAi慢病毒载体siTHAP11-1和siTHAP11-2并获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达1.8×108TU/ml。感染K562细胞后建立稳定株,THAP11的蛋白水平和mRNA水平均有下调。感染CD34＋细胞效率达30%以上,siT-HAP11-1可下调THAP11mRNA约80%,siTHAP11-2约下调85%。结论成功构建THAP11的RNAi慢病毒载体,包装后的病毒颗粒可有效敲低细胞株及原代细胞中内源性THAP11的表达,为后续研究THAP11对CD34＋细胞的影响奠定基础。     

PCGF1过表达慢病毒载体的构建及稳定过表达A549细胞系的建立

目的 构建人多梳家族环指蛋白1(PCGF1)基因的慢病毒载体,建立稳定表达PCGF1基因的细胞系.方法 根据人PCGF1序列设计并合成引物,以A549细胞cDNA为模板,PCR扩增目的基因.双酶切目的基因并插入pLVX-IRES-puro质粒,对重组质粒进行慢病毒包装,用包装好的病毒感染A549细胞系,通过嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,Western blotting验证PCGF1表达情况.结果 重组质粒经测序分析正确,瞬时转染293T细胞后,Western blotting验证PCGF1表达明显升高.包装慢病毒颗粒后感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选后,Western blotting验证得到PCGF1稳定过表达的A549细胞系.结论 成功构建了pLVX-IRES-PCGF1-puro慢病毒过表达载体和PCGF1稳定过表达的A549细胞系,为进一步研究PCGF1的功能奠定了基础.     

小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stbl3感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度.结果 测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果 显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存.系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml.结论 成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

腺病毒-甲病毒杂合载体的构建

目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下：利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子（CD11a promoter,CD11Ap）、甲病毒载体元件（nsP）、目的基因（GFP）、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数（100MOI）分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP＋细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP＋细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。     

CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA-Lentivector载体连接得到LV-CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV-CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151 RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×108ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。     

长链非编码RNA-GAS5慢病毒表达载体构建及其转染效率鉴定

目的构建长链非编码RNA-GAS5(lncRNA-GAS5)过表达及干扰慢病毒载体,并在人滋养细胞中进行转染效率鉴定。方法获取lncRNA-GAS5基因序列,合成重组lncRNA-GAS5全基因序列,同时设计并合成3条lncRNA-GAS5 RNAi序列,构建过表达及干扰慢病毒载体,转染至293T细胞包装病毒并测定其滴度,转染人滋养细胞株HTR-8/SVneo后,使用荧光显微镜观察荧光表达情况,采用实时定量聚合酶链式反应法检测lncRNA-GAS5表达,并筛选出最佳干扰效率的表达载体。结果过表达载体感染细胞后,其表达量提高了2.12倍;干扰载体感染细胞后,其表达量降低了67.3%。结论本实验成功构建了lncRNA-GAS5慢病毒过表达和干扰载体,可为后续进一步研究提供基础。