Experimental Study on AT1-receptor-peptide-induced Myocardial Immune Damage in Rat

The role of autoimmune reaction has more andmore drawn attention in cardiovascular diseases.Itisautoantibodies,against G- protein- coupled cardiovas-cular receptors such as M2 - muscarinic andβ1 - adren-ergic receptors and against ADP/ATP carrier,thatplay an important role in dilated cardiomyopathy( DCM) ,displaying non- desensitized agonist- like ac-tivity[1— 4 ] .There is a lot of research evidence thatimmune alterationscan contribute to the pathogenesisof hypertension[5] .Autoantibodi…     

合成肽检测抗α1-肾上腺素受体自身抗体方法及其临床意义

目的 建立α1－肾上腺素受体（anti－α1－AdR）自身抗体的ELISA，评价其与高血压的关系。方法 以合成的α1－肾上腺素受体细胞外第二环功能表位肽段（α1－192－218位氨基酸）作抗原，建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA），检测98例难治性高血压、96例非难治性高血压患者和40例正常人血清中anti－α1－AdR。结果 阳性参考血清批内变异系数（CV)批间CV分别为0．072、0．101。用抗原吸收后，吸光度（A）值降低1．3倍。98例难治性高血压患者中，anti－α1－AdR的阳性率为36．7％（36／98），明显高于非难治性高血压组13．53％（13／96）和正常血压对照组（5．0％（2／40）。结论 检测抗α1－肾上腺素受体自身抗体的方法特异性和敏感性较高，操作简便，检测该抗体有助于难治性高血压的原因和指导降压药物的选择。     

激动样活性抗α1-肾上腺素受体胞外第二肽段抗体的制备

目的:制备提纯抗α1-肾上腺素受体抗体,并对其生物学活性进行鉴定。方法:实验于2003-02/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。①选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,取4只用于抗α1-肾上腺素受体抗体的制备。将合成肽用戊二醛与牛血清白蛋白偶联,透析除去未结合的多肽,与等体积的弗氏佐剂混匀后于0,2,4,6,8周对大鼠进行免疫处理,4只/次。另2只作为未免疫对照。免疫前后鼠尾采血并用ELISA法检测抗体的滴度,α1-肾上腺素受体抗原的包被浓度50mg/L,血清稀释度从1∶40开始倍比稀释,辣根过氧化物酶酶标抗体稀释度为1∶2000。用阳性血清与阴性血清的吸光度之比来判定,比值≥2.1为阳性。免疫结束后采血,离心取上清,与等体积的生理盐水混合后逐滴加入饱和硫酸铵至浓度达50%,于磷酸盐缓冲液中透析。②以合成的α1-肾上腺素受体胞外第二肽段多肽为抗原,采用免疫亲和层析的方法,纯化用合成肽免疫大鼠产生的抗α1-肾上腺素受体多克隆抗体,用Bradford对抗体进行定量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳检测抗体纯度,以ELISA法、免疫组化、免疫印迹方法进行抗体免疫活性分析,用激光共聚焦测量细胞内游离钙浓度变化以检测抗体的激动样活性。结果:实验选取清洁级1月龄雄性Wistar大鼠6只,全部进入结果分析。①抗α1-肾上腺素受体抗体的产生和纯度:抗α1-肾上腺素受体抗体在大鼠免疫后2周开始产生,8周后达到很高滴度。提纯的抗体聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定有较高的纯度。②纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的免疫学活性:抗体浓度为0.1g/L时滴度约1∶2560,并可结合培养平滑肌细胞及心肌组织上的α1-肾上腺素受体,具有较好的反应原性。③纯化的抗α1-肾上腺素受体抗体的生物学活性:抗α1-肾上腺素受体抗体可显著升高分离的成年大鼠心肌细胞游离钙离子浓度,高达(139.6±15.5)%。该抗体的作用可被Prazosin阻断,降至(28.9±12.64)%,具有特异性及激动样活性。结论:采用自制的免疫亲和层析柱可将合成肽免疫产生的具有激动样活性的抗α1-肾上腺素受体抗体纯化。     

高血压脑卒中患者血浆抗血管紧张素Ⅱ受体1型自身抗体的作用

目的:分析抗血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)受体1型(AT1)自身抗体与AngⅡ在高血压脑卒中的作用及其关系。方法:以合成的AT1-受体胞外第二环多肽片段作为抗原,用酶联免疫吸附试验法检测高血压脑卒中患者及正常人(各281例)血浆中的抗AT1-受体自身抗体,AngⅡ及肾素活性用放射免疫方法测定。结果:高血压脑卒中组抗AT1-受体自身抗体的阳性率(45.6%)显著高于对照组(9.3%,χ2=93.6,P<0.01);高血压脑卒中组及对照组血浆AngⅡ分别为(62.00±58.58)pmol/L和(42.70±28.65)pmol/L(t=4.962,P<0.01),肾素活性分别为(0.64±0.61)ng/(mL·h)和(0.46±0.44)ng/(mL·h)(t=4.027,P<0.01),均有显著差异。按脑卒中类型及脑卒中发病时间分组,抗AT1-受体自身抗体的阳性率、AngⅡ及肾素活性差异无显著意义;AngⅡ水平较高者抗AT1-受体自身抗体的阳性率显著高于AngⅡ较低者。结论:抗AT1-受体自身抗体、AngⅡ及肾素可能参与高血压脑卒中的进展,AngⅡ水平升高引起血管损伤可能是抗AT1-受体自身抗体产生的原因。     

AT1受体胞外肽段AT12181主动免疫自发性高血压大鼠的肾脏保护作用

目的研究血管紧张素Ⅱ的受体1型(AT1)胞外的肽段ATR12181主动免疫自发性高血压大鼠(SHR)后是否对肾脏具有保护作用.方法根据大鼠AT1受体胞外肽段氨基酸序列设计合成多肽片段ATR12181,并作为抗原,主动免疫SHR和WISTAR大鼠,SHR用药组给予氯沙坦(10mg·kg-1·d-1)灌胃治疗,对照组皮下注射弗氏不完全佐剂,实验期间动态监测血清抗体滴度,用尾套法监测收缩压,以光镜和电镜观察肾脏的病理变化,并用RT-PCR方法半定量检测肾脏组织中AT1受体、C-fos、C-jun基因表达.结果ATR12181免疫SHR后产生高滴度的抗体,在免疫后第16周抗体滴度峰值达7100±280,并在免疫四周后开始降低血压,20周末收缩压为(145.42±8.46)mmHg,显著低于SHR对照组(197.00±7.70)mmHg,P＜0.05,与氯沙坦组无差异(139.28±17.19)mmHg,P＞0.05;WISTAR大鼠免疫组产生高滴度血清抗体,血压正常(116.57±5.50)mmHg.光镜下,AT12181免疫SHR组及氯沙坦治疗组肾小球大部分为轻度至中度硬化,少数肾小球形态正常,出入球小动脉管壁轻度至中度增厚;肾小管间质炎性细胞浸润显著减少;电镜下,在ATR12181免疫SHR组及氯沙坦治疗组中,肾小球血管袢排列轻度不规则,基底膜无明显增厚,少许足细胞肿胀,无明显的肾小管变性坏死;与SHR对照组相比,病理改变显著减轻;WISTAR大鼠免疫组与正常对照组相比无改变.并且ATR12181免疫SHR组肾脏AT1R、C-fos、C-jun基因表达水平下调,与氯沙坦治疗组无明显差异(P＞0.05),与SHR对照组相比,有显著性差异(P＜0.05).WISTAR大鼠免疫组与正常对照组相比无改变.结论用AT1胞外肽段ATR12181主动免疫SHR,可产生高滴度血清抗体,降低血压,延缓SHR肾脏病变进程,保护肾功能,其机制和效应与氯沙坦作用类似.正常大鼠免疫后可产生高滴度抗体,但血压和肾脏无异常改变.     

血管紧张素Ⅱ1型受体胞外第二环肽抗体对大鼠血管平滑肌细胞质游离钙水平的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1受体)细胞外第二环肽抗体对培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)细胞质游离钙水平的影响。方法采用酶联免疫吸附测定法检测高血压患者血清中抗AT1受体抗体,亲和层析法提取阳性血清中的AT1受体细胞外第二环肽抗体。同时应用AT1受体胞外第二环肽主动免疫大鼠并提取抗体。将血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),患者及大鼠的AT1受体胞外二环肽抗体分别刺激钙离子荧光探针Fluo-3/AM负载培养原代大鼠VSMC,观察荧光强度变化来检测细胞质游离钙水平变化。结果患者及大鼠血清中提取的AT1受体第二环肽抗体均刺激培养VSMC使细胞质游离钙水平升高,作用与AngⅡ类似。进一步实验发现抗体的激动效应能够被AT1受体胞外第二环肽的抗原表位序列及AT1受体拮抗剂氯沙坦阻断。结论针对AT1受体胞外第二环肽抗体具备激动效应,通过激动AT1受体刺激细胞质钙离子浓度增高,提示该抗体在高血压发病机制中起重要作用。     

梅雨时节 心脏病患者须牢记“三个要”

每年6月中旬到7月初之间的“梅雨”季节是我国长江中下游地区特有的气候。在这个寒暑交替的季节里,冷空气的势力逐渐减弱,暖空气的活动不断加强,海洋上空的水汽通过东南季风源源不断地向大陆输送,造成连绵不断的阴雨。由于此期间是一年中雨水比较集中的时段,且恰值梅子成熟,故谓之“梅雨”,又因其沾人及物皆生黑霉,故又称“霉雨”。     

98例难治性高血压因素分析

目的 :探讨引起难治性高血压的发病因素 ,提高此类高血压的处理对策。方法 :将确定为难治性高血压的病人 ,进行临床分析和实验室检查 ,进行了为期 6个月的跟踪随访和规划治疗 ,最终确定引起病人血压控制困难的主要因素。结果 :引起病人血压控制困难的因素分别为用药方案欠合理占2 2 % ,顺从性差占 19% ,存在潜在继发性高血压因素 4 % ,白大衣性等高血压占 6 %。同时 ,难治性高血压病人组抗AT1受体自身抗体和抗α1受体自身抗体的阳性率及血管紧张素Ⅱ、儿茶酚胺水平也明显高于非难治性高血压和正常对照组。规划治疗提高了高血压的控制率。部分原因可能与更多使用了阻断AT1受体和α1受体的药物有关。结论 :难治性高血压的因素较多 ,要对病人认真分析 ,动态随访并增强其治疗随从性 ,提高高血压的控制率。同时 ,神经内分泌免疫因子可能参与了难治性高血压的发病 ,其检测可能有利于药物的选择。     

血管紧张素AT1受体短肽对自发性高血压大鼠血压、心脏及血管的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型(AT1)受体细胞外的不同肽段对主动免疫自发性高血压大鼠(SHR)血压及靶器官的影响.方法4周龄SHR随机分成5组,每组7只.免疫组有3组,在SHR血压升高后,以合成的AT1受体细胞外的多肽片段ATR12185、ATR10014和ATR12181作为抗原,分别主动免疫,SHR用药组给予氯沙坦(10mg·kg-1·d-1)灌胃治疗,对照组饮水灌胃.同龄Wistar大鼠随机分成4组,每组7只,免疫干预组同SHR,对照组只用免疫佐剂.ELISA法检测免疫组动物的抗体滴度,用大鼠尾动脉血压计观察大鼠血压的变化.试验结束前,测定心脏及左心室重量、肠系膜三级动脉中层及内径,观察心肌及肠系膜三级动脉病理改变,以及心肌超微病理结构改变.结果SHR于6周龄血压开始升高;所有免疫组动物均产生了针对特定短肽的抗体.ATR12181免疫组SHR收缩压于免疫后一个月降低,并持续至实验结束[(145.42±8.46)mmHg,n=7],与SHR对照组[(197.0±7.7)mmHg,n=7,P＜0.05]相比,收缩压明显降低,与氯沙坦治疗组[(139.3±17.2)mmHg,n=7]相比,P＞0.05],而ATR12185免疫组[(183.42±19.26)mm Hg,n=7]和ATR10014免疫组(191.6±15.0)mm Hg,n=7]SHR收缩压无明显变化.Wistar大鼠免疫前后收缩压无明显变化,试验结束时,ATR12181收缩压[(116.6±5.5)mm Hg,n=7],ATR12185收缩压[(116.0±9.5)mm Hg,n=7],ATR10014收缩压[(121.57±4.79)mm Hg,n=7],与对照组[(113.14±9.52)mm Hg,n=7,P＞0.05]无差别.ATR12181免疫组SHR心脏/体重(4.66±0.50)mg/g以及左心室/体重(3.6±0.5)mg/g较SHR对照组心脏/体重(5.16±0.11)mg/g、左心室/体重(4.2±0.1)mg/g降低,P＜0.05,与氯沙坦心脏/体重(4.4±0.6)mg/g及左心室/体重(3.5±0.3)mg/g相比,无显著性差异,P＞0.05.同时肠系膜三级动脉中膜厚度/管腔半径及中膜面积/管腔面积降低.结论用ATR12181主动免疫SHR,可降低SHR血压,降低心脏重量,逆转心脏超微结构的损害,同时降低肠系膜三级动脉中膜厚度/管腔半径及中膜面积/管腔面积降低.     

高血压与自身免疫

高血压病是以体循环动脉压升高为主要特征的一种全身性疾病 ,发病机制十分复杂 ,常常是多种因素综合作用的结果 ,包括肾脏调节血压功能紊乱、肾素血管紧张素系统及交感神经系统活性增强、血管内皮细胞功能异常、高胰岛素血症及遗传因素等。除此之外 ,自1970年 Ebringe和 Doyle发现 30 %良性高血压和恶性高血压病人中存在血清免疫球蛋白水平的显著增高以来 ,众多资料表明在实验性高血压动物和临床高血压病人中存在自身免疫现象。本文仅对高血压病中存在的异常免疫现象及自身免疫反应在高血压发病中的作用作一综述。1　自发性高血压动物中存…