栉孔扇贝秋季苗种培育、生长特性的初步研究

2004年9月20日～2005年5月9日,在红岛蛤原良种开发有限公司贝类育苗场进行了栉孔扇贝Chlamys farreri秋季苗种培育及其生长特性的研究。2004年11月中旬得到的壳高约0.1cm的秋季苗种2.2×106粒,在育苗池中暂养,12月份当水温降到8℃左右时移秋季苗种到保温效果比较好的藻类培育池中培养,苗种可安全过冬。次年5月当海区水温回升到10℃左右时将该苗种移到海上养殖区。2005年5～12月,通过对秋季苗种进行定点采样调查和生物学特性测定,结果表明,扇贝壳高的特定生长率SGR(%/d)在0.22±0.30～3.18±0.41之间,壳高与壳长的关系式为L=0.8101H-0.076,壳高、壳长与体重的关系式分别为W=0.1521H2.6268,W=03625L2.2191,成活率(%)在85±2.45～97.2±2.0之间。5～12月栉孔扇贝没有出现大量死亡现象,顺利地度过了夏季高温期。     

溶藻弧菌对华贵栉孔扇贝体内几种酶活性的影响

对华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）注射不同密度的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）,于注射后6,12,18,48,72h测定体内过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）、碱性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）的活力。结果表明：5×107cell.mL-1,5×108cell.mL-1组血淋巴中CAT活性均有升高趋势,其中5×108cell.mL-1组在18h极显著增加（P≤0.01）,24h显著增加（P≤0.05）。5×108cell.mL-1组SOD活性最初表现为抑制,在12h和18h显著低于对照组（P≤0.05）,24h后明显升高,5×107cell.mL-1组与对照组相比差异不明显。肝脏中ALP活性在18h与对照组相比,5×108cell.mL-1组极显著升高（P≤0.01）,5×107cell.mL-1组显著升高（P≤0.05）。注射后ACP活性有明显升高的趋势,5×108cell.mL-1组在12h和18h显著高于对照组（P≤0.05）,且在注射后24h5×107cell.mL-1,5×108cell.mL-1组活性均达到最高。     

栉孔扇贝类立克次体自然感染调查及人工感染试验

从 1999年 10月至 2 0 0 1年 3月对导致栉孔扇贝 (Chlamysfarreri)大规模死亡的可疑病原进行了系统调查 ,在栉孔扇贝体内发现 1种细胞内寄生原核生物。根据该原核生物超微形态结构及所形成的包涵体形态特征及染色性质分析 ,初步确定为类立克次体 (Rickettsia likeorganisms ,RLO)。该RLO大小为 (3.6 2 3± 1.4 35 ) μm× (1.343± 0 .32 6 ) μm (n =4 5 ) ,主要寄生在栉孔扇贝的鳃、消化腺的上皮组织中。其感染率和感染强度与水温及栉孔扇贝死亡率呈负相关关系。人工感染试验证明 ,RLO可引起栉孔扇贝感染 ,但不形成大面积明显的组织病理变化。本研究表明 ,RLO对栉孔扇贝不具明显的致病性 ,不是导致栉孔扇贝大规模死亡的主要原因。     

栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发育的细胞学荧光显微观察

用1500μW/cm2的紫外线照射长牡蛎(Crassostrea gigas)精子60 s以进行灭活处理,并使之与栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵子受精,在卵子受精后排出第一极体前用6-DMAP(50 mg/L)处理受精卵,持续处理35 min,抑制第一极体和第二极体的排放,诱导异精雌核发育四倍体。采用二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光染色显微观察法,对灭活的长牡蛎精子诱导的栉孔扇贝雌核发育四倍体早期胚胎发育过程进行细胞学观察。结果表明:经紫外线灭活过的长牡蛎精子进入栉孔扇贝卵子后发生轻微膨胀;在第一次卵裂中期,精核形成一致密的染色质小体(DCB),位于两组分开的母本染色体之间,不参与核分裂;第一次卵裂结束时DCB滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其中一分裂球中;第二次卵裂过程中,DCB的去向与第一次卵裂时基本一致。6-DMAP处理有效地抑制了第一极体和第二极体的排出,从而使雌核四倍化。对担轮幼虫染色体倍性分析结果表明,通过本方法可以获得6.25%的四倍体幼虫。本研究还对灭活的异源长牡蛎精子诱导栉孔扇贝雌核发育四倍体过程中产生的复杂倍性、核物质分离紊乱及多精附卵现象进行了观察和分析。     

富集文库－菌落原位杂交法筛选栉孔扇贝的微卫星标记

应用微卫星富集文库─菌落原位杂交法,筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记.用固定了(AG)15和(AC)15探针的尼龙膜(Hybond N )捕捉含有微卫星DNA的片段,经洗脱、PCR扩增和TA克隆,构建栉孔扇贝的微卫星富集文库.利用ECL试剂盒(Amersham公司)标记的(AG)15和(AC)15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库,阳性克隆经测序获得微卫星DNA.富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后,532个(44.3%)为阳性克隆.任意挑选100个克隆测序,结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点.利用软件设计了65对特异性PCR引物,40对能扩增出清晰的带谱;利用48个栉孔扇贝个体评价微卫星位点,分析表明37个位点具有多态性.不同的位点获得的等位基因数目为2～14个不等,37个多态性位点共获得258个等位基因,平均每个位点获得7.0个等位基因.观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量值(PIC)的范围分别为0.1000～1.0000、0.1197～0.9831和0.1172～0.9782.结果表明,富集文库─菌落原位杂交法适合大规模筛选目标物种的微卫星标记.     

Genetic analysis of Aequipecten opercularis and Mimachlamys varia (Bivalvia: Pectinidae) in several Atlantic and Mediterranean localities, revealed by mitochondrial PCR-RFLPs: a preliminary study

Aequipecten opercularis (Queen scallop) and Mimachlamys (Chlamys) varia (Black scallop) are important natural resources occurring in Atlantic and Mediterranean coasts. To develop an optimal sustainable exploitation plan, it is important to study the genetic structure of the different populations. In this study, we used polymerase chain reaction‐restriction fragment length polymorphisms for the determination of the genetic variation and population structure of these two species in different localities. Ten composite haplotypes were generated for A. opercularis and 15 haplotypes for M. varia. Of these, six and four were unique respectively. The analysis of the distribution of the different haplotypes between the localities showed no clear evidence of subdivision in A. opercularis, while in M. varia the results indicated that the two localities analysed should be managed as separate stocks.     

栉孔扇贝消化盲囊亚细胞组分分离与鉴定技术

采用匀浆、差速离心、镜检和标志酶测定等方法,研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)消化盲囊亚细胞组分分离与鉴定技术。结果显示,经Hoechst33258染色,在匀浆2min对照组中,观察到大量栉孔扇贝消化盲囊完整细胞,呈圆形或椭圆形,细胞膜完整,荧光强度较高;在匀浆3、4、5 min实验组中,完整细胞数目逐渐减少,且出现许多形态较小、荧光强度弱、轮廓模糊的细胞碎片。通过血球计数板法得到的细胞破碎结果与上述染色结果一致,随着匀浆时间(2~5 min)的增加,细胞破碎率升高,当匀浆时间达到5 min时,细胞破碎率升至94.24%。利用Hoechst 33258染色栉孔扇贝消化盲囊亚细胞分离组分(S2、C2、C4、S5和C5),镜检发现,C2组分荧光强度最强,荧光颗粒数目多,而其他组分荧光强度弱,且基本观察不到荧光颗粒。由此推测,细胞核主要存在于C2组分中;同时,细胞膜(5’-核苷酸酶)、线粒体(琥珀酸脱氢酶)、细胞质(乳酸脱氢酶)和微粒体(葡萄糖-6-磷酸酶)标志酶活力在其他亚细胞组分中有少量检出,但它们在S2、C4、S5和C5组分中的的标志酶活性比例较高(分别为63.90%、64.89%、77.82%和67.55%)。由此推测,S2、C2、C4、S5和C5分离组分分别为细胞膜、细胞核、细胞质、线粒体和微粒体。本研究成功构建了栉孔扇贝消化盲囊亚细胞组分分离与鉴定技术方法,为贝类生理机制研究提供技术支持。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒cDNA文库的构建及部分序列分析

急性病毒性坏死症病毒（Acute Virus Necrobiotic Virus,AVNV）已被证实是一种对养殖栉孔扇贝（Chlamys farreri）危害极大的致病病原.本研究应用基因克隆技术对AVNV基因组进行cDNA合成、克隆,并对部分克隆进行序列分析.采用差速和蔗糖密度梯度离心法,分离纯化AVNV.用Trizol试剂抽提病毒RNA,采用随机引物和Oligo（dT）双引物法,SuperScriptⅡ反转录酶合成cDNA,并克隆于pUC118质粒上,利用蓝白斑筛选阳性克隆子,PCR法快速鉴定重组质粒.经筛选得到2个阳性克隆23^#、52^#,插入片段大小约为1200 bp和800 bp.测序结果与GenBank的比对分析显示,尚未有类似的序列报道,提示该病毒可能为一种新发现的病毒.[中国水产科学,2006,13（3）：421-425]     

栉孔扇贝大规模死亡致病病原的研究

对2000-2002年山东沿海6个疫区患病栉孔扇贝进行电镜观察，在消化腺、外套膜、肾和肠的结缔组织细胞和间质细胞中发现一种球形病毒．并引起相直的病理学变化。该病毒具囊膜，直径为130～170nm，核衣壳直径为90～140nm。病毒分离纯化后．观察到的病毒囊膜表面覆有长20nm的纤突。病毒在细胞质中的囊泡样结构内完成装配，其内未发现包涵体存在。从发病疫区栉孔扇贝组织中分离出病毒毒种对键康扇贝进行人工感染。结果显示，各感染实验组发病扇贝表现出与自然海区发病扇贝相同的临床症状。病毒注射组死r二率为?5％，病毒浸浴组死亡率为68．7％．灭活病毒注射组和空白对照组死亡率皆为12．5％。病毒注射、浸浴组与灭活病毒注射组、空白对照组死亡率差异显著。电镜复检结果显示，各感染实验组发病扇贝组织中分布有大量病毒粒子，与自然海区发病扇贝组织所观察到的病毒粒子在形态特征和病理学特征上完全一致。以上结果证明，病毒是导致栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。     

氯氰菊酯和氰戊菊酯对栉孔扇贝抗氧化能力的影响

研究了用不同浓度的氯氰菊酯(5、25、125μg/L)和氰戊菊酯(25、125、625μg/L)浸泡栉孔扇贝Chlamys farreri3、6、9、12和15 d后,对血清、内脏囊和鳃组织中的SOD、CAT活性及血清总抗氧化能力(T-AOC)的影响。结果表明:栉孔扇贝血清和各组织中的CAT活性随着氯氰菊酯浓度的升高而增加,氯氰菊酯浓度为125μg/L时,CAT活性最高;而氰戊菊酯浓度为25μg/L时,CAT的活性最高,然后随着浓度的增加其活性降低;当氯氰菊酯和氰戊菊酯浓度分别为5、25μg/L时,各组织中SOD活性和血清T-AOC值出现最大值,然后随着浓度的增加其活性降低。随着农药处理时间的延长,血清中的T-AOC和SOD活性、组织中CAT活性呈现下降趋势;而组织中SOD活性、血清中CAT活性表现为先上升后下降的趋势。另外,栉孔扇贝的抗氧化能力具有组织特异性,鳃组织中SOD活性值的早期变化可作为两种农药对栉孔扇贝氧化毒性的敏感指标。