栉孔扇贝消化盲囊细菌群落组成的季节变化分析

为分析栉孔扇贝消化盲囊内细菌群落组成及其季节变化,于2009年6月—2010年6月(2月份除外)定期从青岛沙子口流清河湾扇贝养殖海区采集养殖的2龄栉孔扇贝,采用SDS方法提取消化盲囊的总DNA,并通过引物358f和907r采用PCR扩增细菌16S rDNA的V3～V5区序列,利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分离所得扩增序列。DGGE图谱显示,12个月份的样品共有不同位置的谱带11条,其中9条谱带作为共有谱带在所有月份的栉孔扇贝消化盲囊中均有分布,占总谱带数的81.82%,表明整个养殖季节栉孔扇贝消化盲囊内的细菌群落组成相对稳定。对11条DGGE条带进行切胶回收、PCR扩增、纯化、克隆后测序,其中9条谱带克隆测序成功。经BLAST比对搜索,结果显示9条序列与NCBI数据库中的序列相似性达97%～99%,所代表的细菌分别属于4大类群,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和放线菌门(Actinobacteria);NCBI数据库中与其相近的细菌主要为马赛菌属(Massilia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、红球菌属(Rhodococcus)和未培养菌。     

氨基脲在栉孔扇贝(Chlamys farreri)体内生物富集与消除规律研究

采用超高效液相色谱-串联质谱法进行了氨基脲在栉孔扇贝闭壳肌、外套膜与鳃、消化盲囊不同组织中生物富集和消除规律的研究.在所研究的3个组织中,随海水中氨基脲浓度的增加,蓄积量逐渐增加.消化盲囊富集最高值最大,富集能力最强,而且表现出最快的平均消除速度.栉孔扇贝各组织对氨基脲的富集作用:消化盲囊＞外套膜和鳃＞闭壳肌;且各组织中氨基脲含量与曝污浓度呈正相关.氨基脲主要富集在栉孔扇贝的消化盲囊及外套膜和鳃中,闭壳肌中含量较少.栉孔扇贝各组织对氨基脲的消除作用:闭壳肌＞外套膜和鳃＞消化盲囊,但在高浓度条件下,闭壳肌也要经过一段时间的净化,氨基脲含量才能降低至0.50 μg/kg以下.采用DAS 2.0药物代谢动力学参数计算程序,处理曝污后栉孔扇贝体内的氨基脲含量-时间数据,计算有关药物动力学参数.结果发现各组织药物浓度-时间曲线下面积(AUC)相差较大,说明组织不同,对药物的蓄积能力有所差别.以20.0 μg/L浓度为例,经42 d消除试验后,闭壳肌(5.94 μg/kg)、外套膜与鳃(9.87 μg/kg)及消化盲囊(15.81 μg/kg)中均有氨基脲存在,且远高于规定值,各组织氨基脲消除率逐渐降低,依次为91.3％、90.0％、89.6％.在本试验条件下,氨基脲在1.0、5.0和20.0 μg/L浓度下连续曝污8d后,消除期分别定为15、50和70 d;并且水温高时可适当缩短消除期,水温低时可适当延长消除期.     

栉孔扇贝鳃细胞原代培养与B[α]P细胞毒性检测技术的研究

本研究优化了栉孔扇贝(Chlamys farreri)鳃细胞制备方法和原代培养条件,采用3种细胞活性检测技术,比较分析了苯并(a)芘(B[α]P)对栉孔扇贝鳃细胞的毒性作用。结果显示,栉孔扇贝鳃组织在1%青霉素–链霉素(双抗)和庆大霉素消毒10~30 min内,原代培养鳃细胞存活率无明显差异。消毒30 min时,镜检无染菌现象,细胞状态良好。胰蛋白酶消化时间对鳃细胞收获量影响显著,在消化15~25 min内,鳃细胞存活率较高,胰蛋白酶的最佳消化时间为25 min。在150~300 g相对离心力作用下,鳃细胞形态和存活率存在明显差异,在150 g时,存活率和细胞完整性较好。添加胎牛血清(5%~20%)在6~12 h内鳃细胞存活率无显著变化,培养24 h时,5%和20%处理组存活率显著下降,10%和15%处理组存活率无明显变化。台盼蓝拒染法细胞活性检测表明,B[α]P对栉孔扇贝鳃细胞活性无明显影响;CCK8试剂法得出,仅在16 μg/mL最高浓度下,鳃细胞活性受到显著抑制;而中性红比色法显示,鳃细胞毒性作用与B[α]P浓度、染毒时间呈正相关性。研究表明,栉孔扇贝鳃细胞最佳制备方法：消毒30 min、胰蛋白酶消化25 min、相对离心力为150 g、原代培养基添加10%胎牛血清为最佳。同时,中性红比色法可以作为评价B[α]P对栉孔扇贝鳃细胞毒性的敏感指标。     

多氯联苯(PCBl254)对栉孔扇贝消化盲囊和鳃丝EROD、GST酶活力的影响

研究了4种质量浓度（0．5μg／L、1μg／L、10μg／L、50μg／L）PCB1254暴露下，栉孔扇贝（Chlamys ferrari）消化盲囊和鳃丝7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶（EROD）、谷胱甘肽转移酶（GST）活力的变化。于实验开始后0、0．5d、1d、3d、6d、9d、15d、21d、30d取样测定，结果显示，除鳃丝EROD活力在低质量浓度（0．5μg／L和1．0μg/L）随时间变化不明显（P〉0．05）外，其他各处理组PCB1254对栉孔扇贝消化盲囊和鳃丝的EROD都具有明显的激活作用，而且具有明显的剂量-效应关系。低浓度（0．5μg/L、1．0μg/L）处理下，消化盲囊和鳃丝的GST活力都呈现激活的趋势，而高浓度（10μg/L、50μg/L）下，GST活力都呈现先上升后下降的趋势，且鳃丝GST活力变化幅度较为明显。结果表明，EROD和GST活力的变化在一定程度上能够反应PCBs对栉孔扇贝影响的规律性，是合适的毒理学指标，栉孔扇贝是比较好的评价多氯联苯污染的指示生物，本研究也对栉孔扇贝对多氯联苯的生物转化机制作了初步的探讨。[中国水产科学，2008，15（2）：342-346]     

石油暴露对栉孔扇贝免疫酶活性及血细胞稳定性的影响

实验室条件下设置海水石油烃质量浓度分别为0.05 mg/L,0.30 mg/L,0.50 mg/L和1.00 mg/L,以栉孔扇贝(Chlamys farreri)为实验对象,实验时间为30 d,分别在0,0.5 d,3 d,6 d,10 d,15 d,21 d和30 d取样,测定其消化盲囊、鳃丝和血淋巴部分免疫酶活性和细胞稳定性指标。结果显示,低浓度0.05 mg/L处理组,各指标变化不显著(P0.05),0.30 mg/L和0.50 mg/L处理组中,消化盲囊和鳃丝的碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力在实验期间显著升高(P0.05);在高浓度1.00 mg/L处理组,消化盲囊和鳃丝的ALP、SOD和GPx活力在实验中后期接近或者低于对照组的水平,其中鳃丝各指标变化较为明显;0.05 mg/L处理组血细胞膜稳定性未受影响(P0.05),而其余各浓度组在实验中后期都明显低于对照组水平(P0.05),浓度越高,细胞膜稳定性降低速度越快。结果表明,0.05 mg/L低浓度石油烃污染在整个实验时间内并未对栉孔扇贝造成伤害,0.30 mg/L和0.50 mg/L浓度石油烃短期对其造成的影响较小,但随着实验时间的延长,血细胞膜稳定性显著降低(P0.05),机体受到一定程度的损伤;1.00 mg/L浓度石油烃对栉孔扇贝的影响非常明显,3 d内便造成了鳃丝的氧化损伤和血细胞膜稳定性的大幅度降低;相同浓度石油烃暴露下,鳃丝抗氧化酶和ALP的变化较消化盲囊明显,对石油烃反应更敏感;实验中各项指标的变化呈现剂量效应和时间效应关系,可以尝试用作评价海洋石油烃污染程度的生物监测指标。     

栉孔扇贝类立克次体自然感染调查及人工感染试验

从 1999年 10月至 2 0 0 1年 3月对导致栉孔扇贝 (Chlamysfarreri)大规模死亡的可疑病原进行了系统调查 ,在栉孔扇贝体内发现 1种细胞内寄生原核生物。根据该原核生物超微形态结构及所形成的包涵体形态特征及染色性质分析 ,初步确定为类立克次体 (Rickettsia likeorganisms ,RLO)。该RLO大小为 (3.6 2 3± 1.4 35 ) μm× (1.343± 0 .32 6 ) μm (n =4 5 ) ,主要寄生在栉孔扇贝的鳃、消化腺的上皮组织中。其感染率和感染强度与水温及栉孔扇贝死亡率呈负相关关系。人工感染试验证明 ,RLO可引起栉孔扇贝感染 ,但不形成大面积明显的组织病理变化。本研究表明 ,RLO对栉孔扇贝不具明显的致病性 ,不是导致栉孔扇贝大规模死亡的主要原因。     

栉孔扇贝稚贝造血组织的研究

采用石蜡切片和单克隆抗体的免疫组化方法，研究栉孔扇贝稚贝血细胞的分布和造血组织的定位。两种方法所得结果一致：在稚贝的外套膜、鳃、消化盲囊、闭壳肌、肾等处观察到大量血细胞，心脏位于消化腺与闭壳肌之间，闭壳肌、消化盲囊、肾等附近有血窦，血管分布于消化腺、胃、肾、直肠等处，有三个血窦，闭壳肌附近有一膨大突出的囊状组织，外被一层致密的结缔组织薄膜，其内壁血细胞密布层叠，分裂增生，形态多样，腔内充满了基质，靠近闭壳肌一侧有管道相通，并向闭壳肌等器官不断输送成熟的血细胞，该组织结构特点类似血细胞生发中心，并随着扇贝的生长发育逐渐膨大增生，据其结构特点及内部血细胞的形态、分布及免疫特性可初步定为栉孔扇贝稚贝的造血组织。     

间接免疫荧光法检测栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒

用纯化栉孔扇贝(Chlamys farrei)急性病毒性坏死症病毒(AVNV)免疫兔子,以兔抗血清为一抗,荧光标记的羊抗兔抗体为二抗,采用冰冻切片技术,建立了栉孔扇贝AVNV的间接免疫荧光检测方法。用该方法分析栉孔扇贝和海湾扇贝(Argopecten irradians)体内AVNV感染强度,并对感染率进行统计。结果表明,栉孔扇贝的肾脏、肝胰腺中,AVNV阳性信号最强,呈现中度到重度感染,其AVNV感染率100％。鳃丝、性腺及闭壳肌中未检测到阳性信号。在海湾扇贝的肝胰腺及肾中AVNV的感染率也较高。提示AVNV感染扇贝的靶器官主要是肾脏、肝胰腺。对与栉孔扇贝同一海区养殖的海湾扇贝在栉孔扇贝发病期间存活率较高的原因进行了讨论。     

栉孔扇贝（♀）×长牡蛎（♂）受精过程的荧光显微观察

采用二氨基苯基吲哚(DAPI)染色荧光显微方法,对栉孔扇贝(Chlamys farreri♀)×长牡蛎(Crassostrea gigas♂)受精过程进行详细观察。结果显示,长牡蛎精子能迅速附着并穿过栉孔扇贝卵膜,精核发生解凝缩而膨胀形成雄性原核;精子入卵后,栉孔扇贝卵子减数分裂重新启动,释放极体并形成雌性原核,最后雌、雄原核融合,受精卵开始第1次卵裂。栉孔扇贝与长牡蛎杂交受精率一般在40%左右。受精卵发育过程中出现了排放2个极体、排放1个极体、不排放极体3种类型,所占受精卵比例约为65%、25%和10%。多数受精卵第1次卵裂后期,染色体发生异常分离,不能平均分配到2个子细胞中,这可能是造成早期胚胎畸形,只能发育到担轮幼虫阶段而全部死亡的主要原因。     

栉孔扇贝不同组织中镉的微区分布特征及其变化规律

为阐明扇贝特异性富集镉(Cd)的机理,研究了栉孔扇贝不同组织中Cd的微区分布特征,并结合Cd的生物动力学实验研究了其变化规律。结果显示空白对照组栉孔扇贝内脏、鳃和性腺组织的Cd主要分布在类金属硫蛋白(MTLP)和细胞器中,闭壳肌组织中Cd主要分布在MTLP(占84.6%)。在Cd的富集实验中,内脏和鳃组织中MTLP和富含金属颗粒(MRG)中Cd的含量和所占百分比升高最显著,而细胞器中Cd的百分比明显下降;性腺组织中MTLP、细胞器和MRG组分中Cd的含量均明显升高,其中MRG中Cd的百分比升高,MTLP和细胞器中Cd的百分比逐渐下降;闭壳肌组织中MTLP和MRG中Cd的含量均显著上升,其中MRG组分中Cd的百分比显著升高。在释放Cd的实验中,内脏和鳃组织的MTLP中Cd的含量显著下降,而细胞器、热敏感蛋白(HSP)和MRG中Cd的含量和所占百分比逐渐升高,性腺组织各亚细胞组分中Cd含量均明显下降,但各亚细胞组分中Cd的百分比变化不明显;闭壳肌组织MTLP和MRG中Cd的含量下降,且MRG组分中Cd所占的百分比不断下降。本研究首次表明栉孔扇贝不同组织中Cd在亚细胞组分中的分布特征不同,并且在富集和释放Cd的过程中,内脏和鳃组织中的Cd在各亚细胞组分中不断发生调节和重新分配。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症(AVND)病理学观察与分析

2000~2002年,应用光镜和电子显微技术对AVND发生期间栉孔扇贝(Chlamys farreri)各主要组织器官病理变化进行了连续观察。光镜观察显示,除生殖腺、闭壳肌外,濒死栉孔扇贝的外套膜、鳃、肾、消化腺和肠组织都有不同程度的组织病理变化。病灶主要出现在上述各器官的结缔组织以及上皮组织,病理变化表现为细胞核肿大、固缩、破裂,核染色质边缘化或空泡化,受感染细胞崩解、脱落,留下大片均质无结构的空白区域,形成凝固性坏死,结缔组织细胞质中有嗜碱性包涵体样颗粒存在。电镜观察显示,在病灶出现的组织细胞内,细胞核染色质异常凝集和边缘化、核膜周隙扩张或溶解。细胞器病理变化明显,内质网扩张,核糖体脱落,有髓鞘样小体出现;线粒体肿大、嵴融解,整个细胞出现解体现象。病变的结缔组织细胞与间质细胞细胞质中有大量直径为130~170nm、具有囊膜的球形病毒粒子存在,负染电镜观察表明,病毒囊膜表面覆有长20nm放射状纤突。病毒的发生基质在细胞质内,并被一膜性结构所包围。病毒在宿主细胞中的繁殖分为3个阶段,即病毒发生期、病毒装配期和病毒释放期。病理学观察证明,病毒感染与病理变化具有明显的相关性。     

栉孔扇贝和太平洋牡蛎的唇瓣结构

运用石蜡切片和扫描电镜技术研究了栉孔扇贝和太平洋牡蛎的唇瓣结构。结果表明，2种贝的唇瓣结构都是中间一层结缔组织，两侧被覆纤毛柱状上皮，结缔组织中富含血腔隙。栉孔扇贝唇瓣的粘膜上皮由柱状细胞和杯状细胞组成；而太平洋牡蛎由柱状细胞、杯状细胞和嗜酸性粒分泌细胞组成。扫描电镜下，2种贝唇瓣的褶皱面呈现沟和嵴，纤毛浓密；光滑面纤毛较少。太平洋牡蛎唇瓣褶皱面的游离边缘部分和光滑面有大量的球状突起，这是杯状细胞所在处。纤毛和粘液在食物分栋和运输中起重要作用。     

样品处理对罗非鱼和银鲫肠道消化酶活性测定的影响

近年来,有关鱼类消化酶的研究报告不断增多,为鱼类消化生理的研究提供了大量有价值的实验资料。在鱼类消化酶的研究中,众多研究者采用了基本相近的研究方法[1-5],但有时却得出相矛盾的结果,这种现象似乎不能简单的归结为鱼类消化酶特性的多样性,而由实验方法和手段的差异导     

紫贻贝4种同工酶的组织特异性表达研究

采用聚丙烯酰胺垂直电泳法对紫贻贝Mytilu sedulis的鳃、消化腺、外套膜、足、闭壳肌等5种组织的超氧化物歧化酶（SOD）、三磷酸腺苷酶（ATPase）、苹果酸脱氢酶（MDH）、苹果酸酶（ME）进行了检测分析。结果表明，SOD在紫贻贝的5种组织中均有表达，共有4条酶带，但迁移率最大的酶带在足和外套膜中未出现，而在另外3种组织中呈弱表达；ATPase在除消化腺外的组织中都表现为2条带；MDH在5种组织中都表达出1条酶带，其中足和闭壳肌的MDH染色最深；ME存在1～2条酶带，其中迁移率大的条带在5种组织中都有表达，而迁移率小的条带只存在于外套膜、闭壳肌和足中。从检测结果来看，上述4种酶在紫贻贝体内的表达有一定的组织特异性．     

锌对海湾扇贝中镉累积和亚细胞分布的影响

采用室内模拟混合暴露方式,研究了在镉(Cd)质量浓度一定(0.05 mg/L)的条件下,添加不同质量浓度(0 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L)的锌(Zn)对海湾扇贝整体、组织及亚细胞水平Cd累积和分布的影响。结果表明,Zn能显著抑制扇贝全贝对Cd的富集,并且这种抑制作用随暴露时间的延长和Zn浓度的升高而增强。在扇贝不同组织中Zn对Cd的富集均具有抑制作用,其中以鳃最为明显。在亚细胞水平,扇贝各组织累积的Cd主要分布在类金属硫蛋白(MTLP)和细胞碎片(CD)组分。在内脏各亚细胞组分中,Zn对Cd的抑制作用显著,且Zn的加入使CD中的Cd百分比从32%下降到21%~27%,而MTLP中的Cd百分比从57%增加到59%~67%。鳃组织中Zn对Cd百分比的影响更加明显,CD中Cd百分比从36%下降到14%~17%,MTLP中Cd百分比从59%增加到76%~79%;而性腺中MTLP和细胞器(ORG)组分中Cd百分比受Zn浓度影响较为明显,随着Zn浓度的升高,MTLP中Cd百分比下降,而ORG中Cd百分比升高;肌肉组织中Cd含量及百分比分布在亚细胞水平没有明显规律。     

饥饿对星斑川鲽消化器官形态结构和组织学的影响

在温度(19±1)℃、盐度32±1的条件下,对相同规格体质量为(26.02±0.30)g的星斑川鲽(Platichthys stellatus)分别饥饿5、10、15 d(设为S5、S10、S15组),恢复投喂20 d。采用石蜡切片方法观察星斑川鲽消化器官形态结构,分析饥饿和再投喂对其组织学的影响。形态结构方面,S5组变化相对较小,而S10、S15组变化明显,表现在胃体积缩小,壁变薄;肠管壁变薄变透明,肠系膜因脂肪基本消失而萎缩;肝体积明显缩小,颜色由原来的粉红色变为深黄色。组织结构方面,S5组变化相对较小,而S10、S15组均有不同程度的损伤,表现在胃上皮细胞高度减小,细胞界限变得不清晰,胃腺细胞收缩,分泌颗粒减少;肠皱壁高度下降,上皮细胞高度显著降低,纹状缘高度减小甚至消失,杯状细胞有不同程度的增加;肝组织致密,肝细胞体积缩小,脂质空泡数量减少,细胞界限不明显,排列不规则,细胞内分泌颗粒减少。恢复投喂后,各实验组消化器官形态和组织结构均有不同程度的恢复,恢复投喂结束时,仅S5组恢复到对照组水平,S10、S15组均未达到对照组水平。结果表明,星斑川鲽饥饿耐受时间为5～10 d,超过此范围会对星斑川鲽消化系统组织结构造成不可修复的损害。     

鳗弧菌注射对栉孔扇贝免疫活性的影响

测定了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)注射对栉孔扇贝(Chlamys farreri)胞内活性氧(ROS)含量和过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。结果表明,在注射后5、24、48和72h各免疫指标都有明显变化;胞内ROS含量在24、48和72h明显升高,且均高于对照组,形成抛物线趋势,在48h达到最高;血清中CAT活性均有升高趋势;肝脏中ACP活性在24、48和72h与注射生理盐水组相比明显升高;栉孔扇贝体内ALP活性有明显升高的趋势,且在注射后24h活性达到最高,而后有所下降。结果表明,鳗弧菌对栉孔扇贝免疫系统有明显的刺激作用。     

灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响

为探究灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响,用1×10~6、1×10~7、1×10~8个/mL 3个浓度的灿烂弧菌刺激厚壳贻贝,探讨弧菌刺激后厚壳贻贝的一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)等免疫指标和淀粉酶、蛋白酶等消化酶的变化情况。结果显示,灿烂弧菌刺激48 h后,厚壳贻贝足、鳃、消化腺等组织中仅消化腺的NOS活性较对照组有显著升高,且酶活性随初始细菌浓度的升高而升高,故选用消化腺来测定灿烂弧菌刺激后72 h内的免疫指标和消化酶活性的变化。灿烂弧菌刺激后,48 h内NOS活性较对照组均显著升高。NO含量较对照组均显著升高,与NOS显现相同变化趋势。SOD活性在各浓度灿烂弧菌刺激下较对照组均显著升高,而MAD含量在实验组中含量显著低于对照组。淀粉酶活性在实验组中显著低于对照组,总体呈现先下降后升高的趋势。蛋白酶活性在各实验组中均呈现先升高后下降的趋势。研究表明,灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和蛋白酶活性的升高有诱导作用,但对蛋白酶的活性有抑制作用。本研究初步探明了厚壳贻贝对灿烂弧菌的免疫应答机制,为进一步研究灿烂弧菌和厚壳贻贝相互作用机制以及厚壳贻贝免疫机制奠定了基础。