人肺癌组织细胞中HIN-1基因甲基化分析

目的:HIN-1(High in normal-1)是新近鉴定的一个抑癌基因,在乳腺癌细胞中,HIN-1启动子区的高甲基化导致其表达沉默。本研究拟探讨肺癌组织和6种肺癌细胞株中抑癌基因HIN-1启动子区内的甲基化修饰水平。方法:甲基化特异性PCR(MSP)和Biosulfite(亚硫酸氢钠)测序法鉴定样品中HIN-1启动子内CpG甲基化状态,RT-PCR法检测5-aza-dc处理前后HIN-1在细胞内的表达水平。结果:在60例肺癌样本中,HIN-1启动子甲基化阳性样本为35例(阳性率58.3%),而5例正常肺组织样品均为阴性反应。采用RT-PCR法分析了肺癌细胞株H157,H358,H1299,A549,H727,DMS53内HIN-1基因的表达水平,发现前4种细胞株内HIN-1表达水平极低,也是在这4种肺癌细胞中,HIN-1基因启动子呈高甲基化状态。用去甲基化试剂5-aza-dc处理上述4种细胞96h后,所有这4种细胞内均出现HIN-1基因的重新活化。结论:抑癌基因HIN-1启动子高甲基化导致的HIN-1表达抑制可能是肺癌发生发展的重要因素。     

多胺类似物CPENSpm通过干扰多胺代谢抑制肺癌细胞的增殖

目的研究多胺类似物CPENSpm对肺癌细胞株A549增殖和细胞凋亡的影响,以探讨CPENSpm抗肿瘤的作用机制。方法MTS法分析细胞的增殖速度,化学分析法测定多胺代谢酶的活性,HPLC法分析细胞内的多胺含量,亚凋亡峰测定法和DNA片段化分析法鉴定细胞程序性凋亡。结果CPENSpm处理A549肺癌细胞可导致:①癌细胞生长抑制并激发细胞凋亡;②抑制多胺合成关键酶ODC的活性,活化多胺降解代谢关键酶SSAT和SMO的活性;③耗竭细胞内多胺含量。SMO抑制剂MDL72527可拮抗CPENSpm对A549细胞的生长抑制作用。结论CPENSpm通过干扰A549细胞的多胺代谢途径,耗竭肿瘤快速生长必需的多胺成分,诱导产生活性氧H2O2从而抑制癌细胞生长并激发细胞程序性凋亡。     

N~1-乙基-N~(11)-(环庚烷基)甲基-4,8-二氮杂癸烷对宫颈癌细胞的作用

目的探讨N1-乙基-N11-(环庚烷基)甲基-4,8-二氮杂癸烷(CHEN)对宫颈癌细胞株Siha的抗肿瘤作用。方法MTT法检测细胞的生长情况;流式细胞术及DNA片段化分析法检测细胞凋亡;化学分析法测定精胺氧化酶(SMO)活性。结果CHEN可显著抑制Siha宫颈癌细胞生长,且抑制作用随药物浓度增加而增强,用10μmol·L-1 CHEN处理细胞,24和48h生长抑制率分别高达61%和75%。细胞凋亡分析发现,CHEN处理可诱导Siha细胞凋亡,导致凋亡峰出现和细胞核DNA片段化。在0~20μmol·L-1浓度范围内,CHEN作用24h对Siha细胞SMO活性无明显影响。结论CHEN通过诱导细胞凋亡而抑制宫颈癌细胞生长,该抑制作用与SMO活性无关。     

人精胺/精眯N 1-乙酰基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

 目的制备鼠抗人精胺/精眯N1鄄乙酰基转移酶（SSAT）单克隆抗体,分析该抗体的效价、抗原特异性及其在Western blot和免疫组织化学等分析技术中的可用性。方法在BL21（DE3）中原核表达带6伊His 标签的SSAT 重组蛋白,并用Ni鄄NTA 树脂亲和层析纯化。用SSAT 重组蛋白免疫Balb/C 小鼠,通过杂交瘤技术制备抗SSAT 单克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用ELISA、Western blot及免疫组织化学技术检测。结果成功建立了稳定分泌鼠抗人SSAT的单克隆抗体杂交瘤细胞株,该单克隆抗体可用于ELISA、Western blot、免疫组织化学、免疫荧光等分析技术。结论成功制备SSAT 单克隆抗体,为SSAT 相关的分子和病理研究奠定了基础。     

京尼平苷对大鼠软骨细胞增殖的影响

背景：京尼平苷能够促进韧带成纤维细胞的增殖和胶原的合成,促进组织的修复和韧带损伤的愈合。 目的：观察京尼平苷对大鼠软骨细胞增殖的影响。 方法：采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养,并取第4代细胞给予0,25,50,100 mmol/L京尼平苷干预,利用MTT比色、流式细胞仪检测细胞周期等方法检测药物干预后第4代软骨细胞的增殖情况。 结果与结论：体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形;且随着培养时间的延长及京尼平苷浓度的升高,软骨细胞增殖更为显著(P < 0.01)。     

高表达OAZI-1增加小鼠黑素瘤B16-F1细胞对多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的检测高表达OAZI-1的小鼠黑素瘤B16-F1细胞对抗癌药物多胺类似物CPENSpm敏感性的影响并探讨其作用机制。方法高表达OAZI-1的B16-F1细胞经CPENSpm处理后,MTT法检测细胞增殖;QT-RT-PCR检测细胞内OAZI-1、ODC和OAZ的mRNA表达水平;反相高效液相色谱法检测细胞内多胺含量;化学发光法分析细胞内SMO酶活性。结果高表达OAZI-1显著增加B16-F1细胞对CPENSpm的敏感性,QT-RT-PCR结果显示,OAZI-1高表达增加ODCmRNA但降低OAZ mRNA水平,CPENSpm处理对ODC和OAZ的mRNA水平无进一步影响。与对照细胞相比,CPENSpm处理能更显著性地降低OAZI-1高表达细胞中的多胺含量,同时更强地诱导SMO酶的活性。结论 CPENSpm处理能在更大程度上耗竭OAZI-1高表达的B16-F1细胞中的多胺,由此对该肿瘤细胞显示出更大的细胞毒性。     

不同刷牙次数和刷牙时间对Ⅱ型糖尿病患者牙周附着水平的影响

目的:分析不同刷牙次数和刷牙时间对Ⅱ型糖尿病患者牙周附着水平的影响。方法:选择Ⅱ型糖尿病患者3 972名为研究对象,对每天刷牙次数和每次刷牙时间进行问卷调查,并分析对牙周附着水平的影响。结果:除≥75岁组外,其余各年龄段每天刷牙≥2次者与<2次者相比,牙周附着丧失程度较轻,每天刷牙≥2次、每次≥2 min者与每天刷牙≥2次、每次<2 min者相比,牙周附着丧失程度较轻。结论:每天刷牙≥2次、每次≥2 min有助于减缓Ⅱ型糖尿病患者的牙周附着丧失程度。     

京尼平苷对大鼠软骨细胞增殖的影响

背景:京尼平苷能够促进韧带成纤维细胞的增殖和胶原的合成,促进组织的修复和韧带损伤的愈合.目的:观察京尼平苷对大鼠软骨细胞增殖的影响.方法:采用二次酶消化法获得大鼠关节软骨细胞进行传代培养,并取第4 代细胞给予0,25,50,100mmol/L 京尼平苷干预,利用MTT 比色、流式细胞仪检测细胞周期等方法检测药物干预后第4 代软骨细胞的增殖情况.结果与结论:体外培养的软骨细胞随着传代次数的增加,细胞形态由原代的多角形逐渐变为长梭形;且随着培养时间的延长及京尼平苷浓度的升高,软骨细胞增殖更为显著(P < 0.01).     

人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.     

用SiRNA沉默SSAT基因表达降低人A549肺癌细胞对抗癌多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的 探讨精脒/精胺乙酰转移酶(Spermidine/Spermine N1-Acetyltransferase,SSAT)基因表达沉默对多胺类似物CPENSpm抗瘤活性的影响。方法 用SiRNA技术获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株,QT-RT-PCR 法用于分析SSAT基因的表达水平,MTT法检测细胞的存活率,DNA片段化分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况。结果 成功获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株。用10 μmol·L^-1 CPENSpm处理对照细胞24 h可使SSAT mRNA 水平升高23倍,但在SSAT表达沉默的细胞中CPENSpm无此影响。细胞增殖实验发现,SSAT表达沉默的细胞对CPENSpm (0~20 μmol·L^-1 )的药物敏感性显著性低于对照细胞。细胞凋亡分析发现,10 μmol·L^-1 CPENSpm处理细胞48 h导致对照细胞出现凋亡细胞典型的DNA片段化现象和亚凋亡峰,但在SSAT表达沉默的细胞株中,CPENSpm诱导细胞凋亡的能力明显减弱。结论 CPENSpm诱导肿瘤细胞内SSAT高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一。