新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建

目的进一步改造噬菌体展示载体,使之能更有效地展示各种外源随机多肽文库.方法以pCANTAB5X-IFN-α2b重组质粒为模板,在上游引物中引入Xba Ⅰ、Sac Ⅰ酶切位点,在下游引物中引入Sac Ⅰ、Stu Ⅰ、Sal Ⅰ酶切位点,将用该引物扩增的IFN-α2b衔接片段PCR产物克隆到pMD18-T中,再将该片段用Xba Ⅰ和Sal Ⅰ酶切并将之插入pCANTAB5L的Xba Ⅰ和Sal Ⅰ位点中,经Sac Ⅰ酶切,线性载体片段自连,构成新型噬菌体展示载体pCANTAB5S.结果限制酶切位点SacⅠ被引入到噬菌体展示载体,并校正了pCANTAB5L载体Stu Ⅰ、Sal Ⅰ等位点的读框.结论成功构建了含读框正确的SacⅠ等多个克隆位点的新型噬菌体展示载体pCANTAB5S,可用于各种外源随机多肽文库的有效展示.     

聚乙二醇α2b干扰素联合利巴韦林治疗基因1型HCV感染

美国Ordway研究所Drusano等采用建立评价模型的方法，对基因1型丙型肝炎病毒（HCV）感染者经聚乙二醇α2b干扰素（PEG-IFN α2b）和利巴韦林联合治疗48周的疗程长短以及疗程与停止治疗后持续病毒应答（SVR）的关系进行了研究。     

新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建

目的：将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体pCANTAB5X中，构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量（＞300个氨基酸）功能蛋白的新型噬菌粒展示载体。方法：应用5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ识别序列的引物，PCR扩增获得XbaⅠ－StuⅠ-SalⅠ-KpnⅠ－[G4S]3-NotⅠ衔接片段，将该PCR产物克隆到pMD-18T中，再将该片段插入pCANTAB5X中构建成新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L。结果：限制性内切酶酶谱及DNA序列分析证明[G4S]3多肽接头和限制性内酶切位点XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ序列被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB5L中。结论：成功构建了新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L，并能有效展示功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量功能蛋白。     

重组腺病毒介导IL-12、IL-2联合基因治疗前列腺癌的实验研究

目的　探讨转移性前列腺癌的治疗方法 ,为前列腺癌免疫基因治疗提供实验依据。　方法　采用重组腺病毒介导IL 12、IL 2联合免疫基因疗法 ,对 6 6只C5 7BL/ 6小鼠前列腺癌模型进行致瘤性和抑瘤性观察。　结果　腺病毒AdmIL 12、AdhIL 2能有效表达目的基因。接种野生型 ,转AdLacZ及转AdmIL 12、AdhIL 2混合RM 1细胞的小鼠致瘤比例分别为 10 / 10、10 / 10及 2 / 10 ;成瘤时间分别为 (12 .3± 1.5 )d、(12 .8± 1.0 )d、(2 2 .5± 2 .1)d ;接种 30d后肿瘤结节直径分别为 (35 .0±2 .0 )mm、(34 .0± 2 .6 )mm、(10 .5± 3.5 )mm。与对照组相比 ,转AdmIL 12、AdhIL 2基因RM 1细胞小鼠致瘤率下降 ,成瘤时间延迟 (P <0 .0 1)、瘤结节小 (P <0 .0 1)。AdmIL 12、AdhIL 2瘤体注射还可抑制肿瘤生长 (P <0 .0 1) ,减少肺转移灶数目 (P <0 .0 1)。　结论　IL 12、IL 2联合基因治疗可诱发前列腺癌小鼠的肿瘤特异性免疫反应。     

P388DI细胞株的特性和培养

国内在尘肺、免疫等研究中应用的巨噬细胞都从动物的肺或腹腔中分离。巨噬细胞在体外一般不再进行DNA复制,不能在体外传代,每次实验必须宰杀动物、分离细胞。最近,我们从英国医学研究委员会尘肺研究所引进P388D1细胞株。这种细胞株有吞噬功能,能在体外传代。目前,已在实验室中生长繁殖。为了进一步推广使用,现把它的特性、生长条件和培养方法等作一介绍。     

HCV2a(JFH1)NS5A蛋白在原核和真核细胞中的表达、鉴定及分析

目的在原核与真核细胞中表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)2a型JFH1(japanese fulminanthepatitis 1)株NS5A蛋白,分析JFH1NS5A蛋白与其它基因型NS5A蛋白间的差异,为进一步研究NS5A蛋白在HCV病毒复制中的作用奠定基础。方法PCR特异扩增JFH1NS5A基因,克隆入pET-32a和pEGFP-N1载体中,构建JFH1NS5A的原核和真核重组表达质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。将pET-JFH1NS5A转化大肠杆菌BL21(DE3),pEGFP-JFH1NS5A转染HEK293T细胞,在原核与真核系统中进行表达,并以SDS-PAGE、荧光显微术和Westernblot方法检测。利用PubMedBLAST软件对JFH1与HCV1a、1b、2b和2c型NS5A蛋白间的同源性进行了分析。结果酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pET-JFH1NS5A和pEGFP-JFH1NS5A。SDS-PAGE电泳检测到融合蛋白在原核细胞中的表达,荧光显微镜观察和Westernblot检测到了GFP-JFH1NS5A融合蛋白在HEK293T细胞中表达。BLAST分析显示,JFH1和H77、HC-J4、HCV-J8和BEBE1病毒株NS5A蛋白的同源性分别为57%、60%、68%和74%。结论JFH1NS5A蛋白在原核与真核细胞中表达成功,为研究HCVNS5A在JFH1株病毒高效复制中的作用提供了材料。     

丙型肝炎病毒融合蛋白及融合机制

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）属于黄病毒科、肝病毒属,是有包膜的单正链RNA病毒,其包膜糖蛋白E1、E2均位于病毒颗粒外表面,主要参与子代病毒颗粒的形成（如组装）及病毒新一轮感染（如细胞黏附、受体结合以及膜融合等过程）。目前研究认为,有包膜病毒均通过一个共同机制--膜融合将自身基因组输送至靶细胞,然后进行复制、转录与翻译、子代病毒组装与释放。经受体结合[如Ⅰ型人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV-1）]、pH改变[如流感病毒、登革病毒（dengue virus,DENV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus,SFV）]或二者兼具（如鸟类肉瘤病毒、白血病病毒）的方式,与细胞膜或内体（endosome）膜发生融合[1]。本文将对近年来HCV E1、E2所介导的膜融合研究作一综述。     

山东地区输血传播病毒(TTV)检测及部分基因克隆和序列测定

目的 了解TTV山东分离株感染状况及基因变异的情况。方法应用逆转录聚合酶链反应(PCR)检测26例山东地区非甲-庚型肝炎和12例肝细胞癌患者血清中TTV DNA,并对阳性扩增的产物利用PCR技术直接克隆和测序,分析其基因变异的情况。结果26例非甲-庚型肝炎中11例TTV DNA阳性(42％)。对其中两株(TTVSD4、TTVSD5)部分基因克隆测序,并与日本株(ABOO8394)相比较,其核苷酸旬同源性为99.9％和100％。而12例肝细胞癌患者中3例TTV DNA阳性(25％),对其中一株(TTVSD6)部分基因克隆与测序,与日本株(ABOO8394)相比较,其核苷酸序列同源性为99％;TTV山东株三株间核苷核同源性均为99％。结论本研究证实山东地区非甲-庚型肝炎和肝细胞癌患者中存在着较高TTV感染,TTV感染可能具有嗜肝性,而且可能与肝功能损害有关,是引起非甲-庚型肝炎的重要病原。     

庚型肝炎病毒全基因组cDNA噬菌体随机展示肽库的构建与鉴定

目的：在已建成庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）转基因小鼠模型的基础上,研究ＨＧＶ包膜蛋白Ｅ２在转上鼠体内的表达及定位。并探讨ＨＧＶ在转基因小鼠体内是否引起病理学改变。方法：取小鼠的器官组织用免疫组织化学方法,以ＨＧＶ Ｅ２蛋白的单克隆抗体对ＨＧＶ包膜蛋白Ｅ２的表达进行分析和定位,通过血清ＡＬＴ检测及常规病理学技术观察转基因小鼠不同器官的病理学变化。结果：免疫组织化学结果表明,ＨＧＶ Ｅ２主要表达于转基因小鼠     

庚型肝炎病毒NS5非结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的;研制特异的抗ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ抗体诊断试剂。方法：ＰＣＲ扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＮＳ５基因片段并定向克隆至转座载体ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴａ,转化ＤＨ１０Ｂａｃ感受态细胞,３７℃振荡培养４ｈ使发生转座,于三抗选择平皿筛选重组ｂａｃｍｉｄ。脂质体介导转染ｓｆ９细胞,将转染上清再次感染ｓｆ细胞,以批量表达ＮＳ５重组蛋白。利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法分析,检测重组蛋白。结果：序