小鼠腹腔巨噬细胞培养

巨噬细胞在免疫学、尘肺等研究方面应用很广。国内在分离巨噬细胞时多从豚鼠肺或大鼠腹腔中取得,但此种方法须用体重400～500g的成年豚鼠,动物来源往往发生困难。本文根据国外的方法,用国内的实验条件,从小鼠腹腔中获取巨噬细胞。由于小鼠容易得到,其腹腔巨噬细胞在体外容易生长,存活时间较长,是一种可取的方法。     

免疫磁珠法分选人脑胶质瘤干细胞的体外培养及鉴定

目的:旨在从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并对其干细胞特性加以鉴定,以期对后续个体化敏感药物化疗奠定基础。方法:采用以CD133为标志的免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养,通过免疫荧光技术检测干细胞标志物CD133、Nestin,干细胞特性加以鉴定。结果:新鲜人脑胶质母细胞培养得到悬浮生长的肿瘤干细胞球,其能在体外自我更新、增殖,形成新的克隆性细胞球,保持连续稳定的传代,能表达神经干细胞表面标志物CD133。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论:胶质母瘤细胞株中存在的一小部分CD133+胶质瘤细胞具有干细胞的属性,并能稳定传代增生。     

人急性淋巴细胞白血病MOLT-4细胞裸鼠异种移植瘤模型的建立

目的　建立可移植于裸鼠的、潜伏期短、高致瘤性的人急性淋巴细胞白血病 MOL T- 4细胞株。　方法　初代移植后 ,通过单纯体内传代法进行皮下埋块和体内、体外交叉传代法进行体外传代培养后移植 ,并对移植瘤的生长、组织形态和超微结构、细胞表面抗原表达、染色体核型等进行观察和检测。　结果　体内、体外交叉传代法进行体外传代培养 2 0代后的 MOL T- 4细胞裸鼠移植瘤平均潜伏期为 (2 1 .2 0± 1 .1 0 ) d,致瘤率 1 0 0 %。移植瘤的生长曲线呈“S”型 ;组织形态、超微结构和表面抗原表达特点符合 MOL T- 4细胞特点 ,染色体核型属人类染色体。　结论　通过体内、体外交叉传代法进行体外传代培养 2 0代后的 MOL T- 4细胞能成为潜伏期短、高致瘤性的细胞株 ,此法较单纯体内传代法快速、简便     

肿瘤细胞生长因子的发现与研究通过鉴定

人成纤维细胞样细胞株产生的肿瘤细胞生长抑制因子(HFI)的发现、分离和体外生物学效应研究,最近已通过成果鉴定。完成这项研究的吴克复同志在澳大利亚进修期间,从人成纤维细胞样细胞株中发现了能抑制肿瘤细胞体外繁殖的HFI,经部分提纯测得HFI为分子量55,000的蛋     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及生长特性的初步研究

目的:探索兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离及培养扩增的方法。方法:骨髓穿刺法抽取雄性新西兰白兔髂骨骨髓5ml,联合应用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化MSC并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线。HE染色光镜观察细胞形态。结果:成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法,生长动力学分析发现,传代细胞随传代次数的增加,增殖能力逐渐下降。结论:兔MSC能在体外成功培养、扩增,可作为组织工程的种子细胞。     

C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内的传代研究

目的研究C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内传代中病毒学和免疫学等反应的变化特点,分离制备SHIVCHN19P4中国恒河猴传代适应株病毒。方法选择4只健康成年恒河猴,其中两只经后肢静脉感染SHIVCHN19P4病毒,60 d后,分别采集EDTA抗凝全血静脉途径传代至另两只猴,使用流式细胞术、PCR、结合抗体检测和序列分析等方法研究传代动物病毒学、免疫学和序列变异特点。选择性从传代动物感染急性期外周血中分离PBMC,CD8+T细胞敲除后与正常PBMC共培养分离病毒。结果 4只传代动物均获得系统性感染,且传代后病毒毒力明显增强,序列分析发现SHIVCHN19P4病毒序列在传代过程中发生适应性改变;同时,成功分离制备SHIVCHN19P4传代适应性病毒株。结论 SHIVCHN19P4在中国恒河猴体内适应性传代研究为进一步建立C亚型SHIV强毒株/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为研究C亚型HIV-1流行株致病特点以及预防性黏膜疫苗和杀微生物的有效性评价提供了数据支持。     

用转染技术建立巨噬细胞传代株

本文报告应用转染技术建立巨噬细胞传代株,探讨应用不同来源的DNA获得具有不同功能特性的巨噬细胞株,应用SV40DNA、C-myc基因,U937DNA和胰岛素基因已获得7株细胞,经鉴定它们均有巨噬细胞的特性,即可分泌胶元酶、溶菌酶,其中有30—40％的细胞带有Fc受体,并有经Fc受体介导的吞噬功能。细胞株内细胞功能各异是因为细胞株尚未克隆化。从本试验结果看不仅经转染方法可获得巨噬细胞株,而且有可能经此法获得B或T淋巴细胞传代株。     

小鼠腹水型肝癌高、低转移克隆稳定性的研究

利用小鼠腹水型肝癌高转移克隆16A_3—F_3和低转移克隆A_2—0在体外传代并进行亚克隆,观察其转移能力、核型和细胞电泳率的变化。当每个克隆在培养中生长少于20次传代后进行亚克隆时,则亚克隆群的转移能力、核型和细胞电泳率等变化不大。在培养中连续传45代,则亚克隆之间有明显差别。结果表明,小鼠腹水型肝癌高转移克隆细胞株有效应用时间是在体外传20代以内。因而,可以采用冻存原代细胞以及体内反复筛选和体外亚克隆的方法保持其稳定性。测定转移率是否发生变化的指标,除动物实验外,还可测定细胞电泳率和核型变化,因为对小鼠腹水型肝癌来说,三项指标基本上是呈正相关的关系。     

酶消化法联合组织块法与经典酶消化法体外分离培养黑色素细胞的比较

目的对酶消化法联合组织块法(以下简称"联合法")与单纯酶消化法体外分离培养人黑色素细胞进行比较,以找到更加快速、经济、简便的黑色素细胞体外分离培养方法。方法使用倒置相差显微镜连续多代观察两种方法体外培养的黑色素细胞原代、传代情况,分别从形态学、生长情况等方面对比两种方法培养黑色素细胞的差别。结果细胞形态:联合法分离的细胞同源性好,细胞较细长,树突较多且相互交叉成网状呈集落分布,但初代培养时间较长;酶消化法分离的细胞同源性一般,初代细胞较粗短,树突较少且细胞分布较分散,但初代培养时间短。两种方法细胞形态随着传代次数的增多渐趋一致。生长情况:酶消化法分离的细胞一次可获得较大的细胞量,但容易污染,且初代培养的细胞混有较多的上皮细胞,需多次传代纯化;联合法分离的细胞较单一,但细胞量相对较少,两种方法分离细胞增殖和生长曲线大体一致。结论联合法可获得比较可观的细胞量,两次传代后即可获得比较纯净的黑色素细胞,可避免胰蛋白酶对黑色素细胞的损伤,是较为快速、经济的黑色素细胞体外分离方法。     

小鼠胚胎干细胞建系及GFP标记

目的：为组织工程提供新型种子细胞,建立胚胎干（ES）细胞系。方法：取129／svj白色小鼠4.5d的囊胚,分离囊胚的内细胞团（ICM）细胞;在条件培养液及小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作铺层下,细胞扩增传代,碱性磷酸酶（AKP）染色及oct4、ssea-1等特异性抗体鉴定细胞,并将细胞注射至裸鼠皮下观察细胞在动物体内的生长变化。结果：细胞体外培养呈“巢状”生长,可以持续传代;AKP染色及oct4、ssea-1等特异性抗体免疫反应均阳性;裸鼠皮下注射的细胞发育生长为包含各胚层细胞成分的畸胎瘤。在此基础上以基因转染方法将细胞标记绿色荧光蛋白（GFP）。结论：从小鼠ICM所分离的细胞为小鼠胚胎干细胞,且标记GFP的ES细胞在传代及形成胚体的过程中均能显示GFP,对将来组织构建的种子细胞起到示踪作用。     

兔软骨细胞的体外分离、培养及鉴定

目的探讨体外软骨细胞的分离培养方法。方法采用机械-双酶消化法对兔软骨组织进行消化,以获得软骨细胞,经过体外培养传代后,通过观察显微形态学、细胞增殖生长曲线及Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色对软骨细胞进行鉴定。结果成功建立体外培养兔软骨细胞的培养体系。显微镜显示原代培养的软骨细胞呈多角形或三角形贴壁生长,传代5次后出现"纤维样分化"。物理形态及免疫组织化学染色显示5代以内的细胞可以保持稳定的生物学特征。结论本研究建立的软骨细胞分离方法简单、方便。     

新生大鼠神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的获得新生大鼠神经干细胞,为深入研究其增殖分化奠定基础。方法从新生24小时内大鼠端脑及中脑部位分离NSC,采用体外无血清悬浮培养,以获得能在体外长期生存的NSC;通过单细胞克隆实验检测其自我更新能力,免疫细胞化学检测NSC标志物nestin表达及分化为神经元和胶质细胞的能力;用细胞计数法研究其生长特点并绘制生长曲线。结果获得的NSC能在体外长期生存,具有很强的增殖能力、自我更新能力,能分化为神经元和胶质细胞,具有多向分化能力,表达nestin,体外传代至10代细胞数量扩增了40倍。结论成功地从新生大鼠端脑和中脑中分离得到了能在体外长期培养的NSC。     

兔肋软骨细胞的高效分离及体外培养

目的:研究兔原代肋软骨细胞的高效分离及体外培养快速增殖方法.方法:取2月龄新西兰大白兔肋软骨,以培养液配制的0.1%Ⅱ型胶原酶分离兔肋软骨细胞,检测细胞收获效率和存活率.体外培养并传代,观察细胞形态、生长及胞外基质中胶原的变化.结果:①肋软骨经Ⅱ型胶原酶消化软骨基质逐步解离和降解,细胞被完全分离,细胞存活率平均为97.1%;②原代、第1代和第2代细胞贴壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,麦松三色反应呈阳性,第3代细胞逐渐变为梭形;③传代细胞在75cm2培养瓶中培养的增殖量大约是在25cm2瓶中增殖量的2.96倍.结论:①Ⅱ型胶原酶能完全消化降解肋软骨基质,使细胞完全分离,并具有高细胞收获率和高细胞存活率;②原代、第1代和第2代肋软骨细胞具有良好的生物学活性;③传代细胞在75cm2培养瓶中培养,可以减少传代次数而收获所需数目的细胞.     

稳定表达人GM-CSF和IL-4 EA.hy926细胞株建立及对DC诱导作用

目的获得分别能稳定表达人白细胞介素4(IL-4)和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的内皮细胞株,并用于树突状细胞(DC)的体外诱导培养。方法构建重组的慢病毒表达载体,在293T细胞中进行慢病毒的包装,用获得的高滴度的慢病毒感染内皮细胞EA.hy926细胞株,建立能够高效、稳定表达IL-4和GM-CSF的EA.hy926细胞株。结果 EA.hy926细胞株感染效率达90%以上,长期传代仍能保持较高阳性率。RT-PCR在mRNA水平上检测目的基因有表达;ELISA和Western方法证实感染后细胞IL-4、GM-CSF在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的80倍和143倍。感染后细胞的生长状态良好,能够长期在体外进行传代培养,可以用于DC诱导实验。结论构建的细胞系可以稳定表达细胞因子IL-4和GM-CSF。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

不同组织源性细胞作为大动物骨缺损修复研究用骨组织工程种子细胞的增殖及成骨分化比较

【目的】比较源自同一大动物个体不同组织的成骨性种子细胞的体外增殖及成骨分化能力,寻找和筛选更符合大动物骨缺损修复研究要求的种子细胞来源和分离方法。【方法】选用中国青山羊模型,参照常规方法,分离骨膜、骨髓、脂肪源性细胞进行体外培养,倒置显微镜观察,记录原代细胞的汇合生长时间;细胞传代后成骨诱导培养21 d,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活力;细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性及细胞分泌骨桥蛋白测定、钙结节茜素红S染色检测细胞的成骨分化能力。【结果】骨膜、脂肪、骨髓源性原代细胞汇合生长时间分别为14、11和7 d;传代后MTT法检测显示细胞增殖能力从强到弱依次为骨髓、脂肪、骨膜源性细胞。细胞内ALP活性、细胞分泌骨桥蛋白及钙结节染色显示细胞进入成骨分化的先后顺序依次为骨膜、骨髓、脂肪源性细胞。【结论】在体外培养的各个阶段,来自同一大动物个体的不同组织源性细胞的增殖及成骨分化能力存在明显差异,其中骨髓及脂肪源性细胞更适于大动物骨缺损研究的需要。     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞诱导分化的研究

【目的】探讨犬骨髓基质干细胞的提取、分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

人子宫内膜细胞原代培养方法的改良

目的 寻求一种简便高效的人子宫内膜上皮细胞和间质细胞分离、纯化与鉴定方法,建立稳定的子宫内膜细胞体外培养体系.方法 简化Ryan等的子宫内膜细胞原代培养方法的取材,分离和培养条件,分离出高纯度的子宫内膜上皮细胞和间质细胞进行体外培养和传代.结果 培养成功的子宫内膜上皮细胞与间质细胞均可稳定传代,体外生长10～50 d,纯度均达90%以上.结论 该方法简便高效,可建立稳定的人子宫内膜细胞体外培养体系.     

登革病毒组织培养技术

目的 :探讨对登革病毒敏感性不同的几株蚊子细胞和哺乳动物细胞的体外培养技术。方法 :对白纹伊蚊C6/3 6细胞、伪盾伊蚊Ap 61细胞和三株哺乳动物细胞LLC MK2 细胞、Vero细胞、BHK 2 1/3 1细胞进行体外培养 ,把登革病毒转染到上述细胞中 ,经传代培养后 ,在显微镜下观察。结果 :通过观察结果及时改进各细胞株的培养基的配制、消化方法和传代比例 ,各细胞株均能生长良好、单层致密、无污染 ,登革病毒转染实验呈阳性结果。结论 :实验结果证明白纹伊蚊C6/3 6细胞、Ap 61细胞、LLC MK2 细胞、Vero细胞、BHK 2 1/3 1细胞均为登革病毒敏感细胞 ,其中白纹伊蚊C6/3 6细胞敏感性较高 ,随着新的克隆细胞株的体外培养技术的成熟 ,组织培养已成为登革病毒分离、鉴定的毒力滴定中必不可少的一种常规实验技术     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞 诱导分化的研究

 【目的】 探讨犬骨髓基质干细胞的提取。分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】 从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子-B1(TGF-B1)对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6 ~ 9 d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性。阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】 犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)作用下可被诱导分化为软骨样细胞。