乙型肝炎病毒（adr亚型）转基因小鼠的研究

目的：制备含有2.0拷贝乙型肝炎病毒（HBV,adr亚型）基因组的转基因小鼠,为HBV相关医学问题的研究准备实验动物模型。方法：应用受精卵原核显微注射的方法,产生HBV转基因小鼠。用PCR, Southern-blotting杂交、放射免疫、免疫组织化学以及亚显微结构分析等方法,研究外源基因在转基因小鼠体内的整合、表达以及复制。应用常规病理切片及血清生物化学方法分析转基因小鼠的病理学改变。结果：得到了4只整合有HBV基因组的建立者小鼠,并证明HBV基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,在肝、肾组织内可特异性表达、复制,并在肝细胞内发现了Dane颗粒。转基因小鼠的肝、肾组织未见明显的病理学改变。结论：获得了HBV的转基因小鼠,其病毒基因可以表达,并有病毒颗粒形成。该小鼠对于HBV的各个基因产物是免疫耐受的,其基本生物学特性与人类的HBV携带者特征相似。     

乙型肝炎病毒纯合子转基因小鼠(adr 1.2)的培育

目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。     

HBV转基因在C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU3小鼠基因组中的整合分析

目的:分析HBV转基因在乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系基因组中的整合特征.方法:以F6～F17代乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU为研究对象,采用基因组DNA PCR、Southern印迹和DNA测序的方法,分析HBV转基因在该品系转基因小鼠基因组中的整合特征.结果:PCR分析显示,F6～F17代乙肝转基因小鼠基因组中均已稳定整合了相同拷贝数的HBV转基因,整合的HBV DNA可通过生殖系在世代间稳定遗传.整合在转基因小鼠基因组中的HBV DNA含有HBVpres、s、c、x基因,Southern印迹证实HBV转基因含有全长HBV基因组DNA,DNA测序结果表明,该品系转基因小鼠所整合的转基因为adr亚型的HBV DNA.结论:C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系转基因小鼠基因组中均整合有adr亚型的全长HBV基因组DNA,从DNA水平证实该转基因小鼠品系已具备了乙肝实验动物模型的基本条件.     

乙型肝炎转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.0)SMMU的生物学特征

目的：评价乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU生物学特征的稳定性。方法：以F6代乙肝转基因小鼠C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU为研究对象，采用基因组DNA PCR，血清ELISA检测，Western印迹分析，免疫组织化学，血清DNA PCR，透射电镜和H－E染色的方法分析HBV基因在转基因小鼠中的整合，表达，复制和组织这变化。结果：F6代乙肝转基因小鼠基因组中稳定整合有HBV基因，肝组织中可检测用HBsAg,HBcAg和X蛋白3种病毒蛋白，血清中HBsAg和HBeAg的表达率分别为19．54％和3．39％，且在血清和肝组织中存在病毒NA和病毒样颗粒；长期的病毒DNA整合，表达和复制可以引起转基因小鼠肝，肺等组织的病理性损伤。结论：乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU具有基因组中稳定整合病毒DNA，血清和肝组织中有病毒蛋白表达和病毒复制的特征，并具有一定的组织这变化，作为生物医药研究的实验动物模型具有推广应用价值。     

小鼠白细胞介素-21基因重组腺病毒可控制慢性HBV感染

目的 观察小鼠白细胞介素-21基因重组腺病毒(Ad-GFP-mIL-21)在慢性HBV感染小鼠中的表达以及其对病毒清除和HBV特异性抗体产生的作用.方法 Ad-GFP-mIL-21体外感染HepG2.2.15细胞后分别采用ELISA和Western blot检测上清和细胞mIL-21的表达;尾静脉注射rAAV8-1.3HBV至野生型C57BL/6小鼠体内建立HBV持续表达模型,12周后实验组尾静脉注射Ad-GFP-mIL-21,以注射空载GFP重组腺病毒或PBS为对照组,荧光显微镜观察Ad-GFP-mIL-21在小鼠体内各器官的表达情况,ELISA检测各组小鼠血清HBsAg、HBsAb、HBcAb和mIL-21的水平.结果 Ad-GFP-mIL21可在体外感染HepG2.2.15细胞,且上清mIL-21水平与重组载体的滴度和感染时间相关.注射Ad-GFP-mIL21至HBV持续表达小鼠后第4天观察到绿色荧光主要在肝细胞表达;与处理前相比,注射第4天血清mIL-21水平显著升高(P<0.05),而HBsAg滴度则明显下降;实验组和对照组小鼠在注射第13天血清HBsAb均为阴性;与对照组相比,实验组小鼠血清HBcAb水平显著升高(P<0.05).结论 Ad-GFP-mIL-21在HBV持续感染小鼠体内可表达mIL-21,并能下调血清HBsAg滴度和促进HBcAb产生,提示其在体内具有控制慢性HBV感染的作用.     

SKLB-102对ConA诱导的小鼠急性肝炎治疗研究

目的 研究5-(4-甲氧基苯亚甲基)-2-硫代-二氢嘧啶-4,6(1H,5H)-二酮(SKLB-102)对小鼠急性肝炎的治疗效果.方法 体外巨噬细胞趋化抑制实验,检测SKLB-102对巨噬细胞趋化的抑制作用;建立刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠急性肝炎模型,并在造模后给予SKLB-102进行治疗干预.采用临床自动生化分析检测ALT、AST变化;ELISA检测血清中肿瘤坏死因子(TNF-α )含量;HE染色组织病理学观察,评价SKLB-102治疗效果.结果 体外巨噬细胞迁移实验显示,SKLB-102能明显抑制MCP-1 诱导的RAW264.7细胞迁移; 体内抗急性肝炎效果研究证明,SKLB-102降低ConA诱导急性肝炎模型小鼠血清AST、ALT含量,下调TNF-α表达;组织病理学显示SKLB-102明显减轻急性肝炎小鼠的肝组织损伤及炎性细胞浸润.结论 SKLB-102体外具有明显抑制巨噬细胞趋化作用,体内显示很好的抑制TNF-α产生和治疗急性肝炎效果.SKLB-102治疗急性肝炎效果可能与其抑制免疫细胞趋化和炎性细胞因子产生有关.     

HBV转基因小鼠体内淋巴细胞表型特点及干扰素α对其的影响

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）转基因小鼠体内淋巴细胞表型特点及干扰素α对其病毒学指标和免疫细胞表型的影响。 方法选取HBV 转基因小鼠和野生型（WT）小鼠,采用ELISA检测HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBcAb水平及两组小鼠血 清IL-21及IL-6水平,分离肝、脾以及外周血淋巴细胞,流式细胞术检测CD4+T和CD19+B细胞频数;给予9只HBV转基因小鼠 重组鼠源性干扰素α（rmIFN-α）皮下注射,同时9只HBV转基因小鼠相应注射PBS,观察其血清HBsAg、HBV DNA、IL-6、IL-21 水平的变化以及外周血CD4+T和CD19+B细胞频数变化。结果HBV转基因小鼠的血清HBsAg水平较高并能检测到HBcAb, 其血清IL-21及IL-6水平较WT小鼠显著升高（P<0.05）;HBV转基因小鼠外周血、肝脏以及脾脏淋巴细胞中CD4+T细胞频数较 WT小鼠均明显低下（P<0.05）,但其肝脏CD19+B细胞频数明显高于WT小鼠（P<0.05）;HBV转基因小鼠肝内CD4+T细胞频数 与血清HBsAg水平呈负相关,而肝内CD19+B细胞频数与血清HBcAb水平呈正相关;rmIFN-α处理可显著提高HBV 转基因小 鼠外周血CD4+T和CD19+B细胞频数以及血清IL-6水平（P<0.05）。结论HBV转基因小鼠体内淋巴细胞亚群频数异常,外源性 干扰素α可通过调节淋巴细胞亚群频数发挥免疫调节作用。     

CD137/CD137L信号通路在体外T细胞增殖反应和体内SGVHD诱导中的作用

目的：探讨抗CD137L单克隆抗体在体外、体内阻断CDl37／CDl37L信号通路对T细胞体外增殖的影响以及对小鼠同基因型移植物抗宿主病（syngeneic graft versus host disease，SGVHD）的作用。方法：体外混合淋巴细胞反应中加入不同浓度的抗CD137L单克隆抗体，观察抗体对T细胞增殖的影响。同基因骨髓细胞移植给致死剂量X射线照射的受体小鼠后，腹腔注射环孢素A（cyclosporine A，CsA）诱导SGVHD，并于诱导治疗的第10天起给治疗组小鼠腹腔注射抗CD137L单克隆抗体进行干预治疗。观察各组小鼠的临床症状（体重下降，腹泻），组织病理学和细胞因子改变。结果：体外用抗CD137L单抗阻断CD137／CD137L通路后，可抑制淋巴细胞的增殖和IL-2的产生。体内注射抗CD137L单抗，小鼠SGVHD的发生率为25％，显著低于诱导组小鼠SGVHD67％的发生率，两者差异具有统计学意义（P〈0．01）。SGVHD小鼠肝脏和结肠组织病理学呈严重炎症细胞浸润，组织中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-αamRNA水平升高。而抗体治疗组小鼠组织病理学呈轻度炎症细胞浸润，组织中细胞因子IL-12、IFN-γ、TNF-αmRNA水平较低或检测不到，而IL-4mRNA水平升高。结论：单独用抗CD137L单克隆抗体阻断CD137／CD137L信号通路在体外可明显抑制混合淋巴细胞反应，在体内可明显抑制小鼠SGVHD的发生。     

OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白疫苗的构建表达及其对HBV转基因小鼠的免疫效果研究

目的：构建OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白疫苗来研究对HBV转基因小鼠的免疫效果。方法：将HBsAg‘a’抗原决定簇主要肽段S-（124-147aa）插入到沙门氏菌外膜孔道蛋白OmpC第4 Loop区,并运用DsbA进行辅助二硫键形成,对HBV转基因小鼠免疫,激活固有免疫系统中的B-1细胞产生HBsAb。结果：HBsAg的adr‘a’表位CTSPAQGTSMF-PSCCCTKPSDGNC成功插入OmpC-HBsAg‘a’基因的588~659 bp之间,重组后的载体PCR鉴定和测序结果完全与设计相一致。IPTG诱导表达后,荧光显微镜显示3E7抗体能够识别BL21外膜表面的OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白,用表达该蛋白的BL21直接免疫HBV转基因小鼠,能够产生HBsAb抗体。结论：OmpC-HBsAg‘a’表位嵌合蛋白在原核中表达具有天然构象,以此蛋白为基础的疫苗能够打破HBV转基因小鼠对HBsAg的免疫耐受。     

庚型肝炎病毒全基因组cDNA噬菌体随机展示肽库的构建与鉴定

目的：在已建成庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）转基因小鼠模型的基础上,研究ＨＧＶ包膜蛋白Ｅ２在转上鼠体内的表达及定位。并探讨ＨＧＶ在转基因小鼠体内是否引起病理学改变。方法：取小鼠的器官组织用免疫组织化学方法,以ＨＧＶ Ｅ２蛋白的单克隆抗体对ＨＧＶ包膜蛋白Ｅ２的表达进行分析和定位,通过血清ＡＬＴ检测及常规病理学技术观察转基因小鼠不同器官的病理学变化。结果：免疫组织化学结果表明,ＨＧＶ Ｅ２主要表达于转基因小鼠     

不同乙肝检测模式中Pre-S_1抗原分析

目的:通过不同乙肝检测模式中P re-S1抗原的检测情况分析,了解P re-S1抗原与乙肝病毒复制的关系。方法:采用EL ISA法对300份乙肝阳性血清进行P re-S1抗原检测。结果;P re-S1抗原检测在HB sA g(+)、HB eA g(+)、HB cA b(+)模式的阳性率为86%,在HB sA g(+)、HB eA b(+),HB cA b(+)模式的阳性率为40%,在HB sA g(+)、HB cA b(+)模式中阳性率为25%,而在HB eA b(+)、HB cA b(+)模式中,HB sA b(+)、HB eA b(+)、HB cA b(+)模式中,HB sA b(+)、HB cA b(+)模式中及HB cA b(+)模式中阳性率都为0。结论:P re-S1抗原测定可作为检验乙肝病毒存在和复制的血清学指标。     

乙型肝炎患者血清HBV DNA与HBV-M检测比较分析

目的：探讨不同免疫标志物的乙型肝炎（乙肝）患血清HBVDNA阳性率及其临床意义。方法：用PCR方法检测乙肝患血清HBVDNA，用ELISA方法检测乙肝五项标志物即HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb,HBcAb。结果：212例HBsAg,HBeAg,HBcAb均阳性的标本HBVDNA也全部阳性，阳性率为100%；158例HBsAg,HBeAb,HBcAb均阳性的标本，HBVDNA62例阳性，阳性率为39.2%,HBsAg,HBcAb阳性标本55例。其中30例HBVDNA阳性，阳性率为54.5%; 三抗体HBsAb,HBeAb,HBcAb阳性标本40例，其中5例HBVDNA阳性，阳性率为12.5%。结论：PCR方法更灵敏。只有检测HBVDNA才能确证HBV的真实感染和得制情况。     

HBV感染与AFP相关性的研究

目的 :探讨乙肝各血清学模式中发生癌变的风险。方法 :应用 EL ISA法对 5 6 0例 AFP介于 2 0 ng/ml～4 0 0 ng/m l的乙型肝炎患者及 5 3例有乙肝感染史的肝细胞癌患者 (AFP:4 2 0 ng/ml～ 10 92 ng/ml)进行了乙肝血清学指标测定。结果 :乙肝血清学指标各模式间存在相当大的差异 ,5 6 0例乙肝患者中 M1[HBs Ag(+)、HBe Ag(+)、HBc Ag(+) ]模式占 2 4 .1% ,M2 [HBs Ag(+)、HBe Ab(+)、HBc Ab(+) ]模式占 4 6 .4 % ,M3[HBs Ab(+)、HBe Ab(+)、HBc Ab(+) ]模式占 7.0 % ,M4 [HBe Ab(+)、HBc Ab(+) ]模式占 2 2 .3% ;5 3例肝细胞癌患者中 M1[HBs Ag(+)、HBe Ag(+)、HBc Ab(+) ]模式占 2 2 .6 % ,M2 [HBs Ag(+)、HBe Ab (+)、HBc Ab(+) ]模式占 4 1.5 % ,M3[HBs Ab(+)、HBe Ab(+)、HBc Ab(+) ]模式占 9.4 % ,M4 [HBe Ab(+)、HBc Ab(+) ]模式占 2 6 .4 %。结论 :乙肝各种模式 AFP的增高有高度相关性。     

原发性胆汁性肝硬化患者血清生化酶谱与乙型肝炎疾病相关的生化酶谱检测及临床意义

目的:通过检测原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者血清乙型肝炎疾病相关抗原、抗体,探讨这些抗原、抗体在PBC患者的阳性状况及临床意义。方法:采用ELISA检测乙肝相关抗原、抗体(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)。用贝克曼全自动生化仪检测ADA、AST、GGT、ALB、ALT。结果:HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBeAb、HBsAb在346例PBC组的阳性率分别是92.5%,(300/346)、86.7%(150/346)、35.8%(124/346)、24.3%(84/346)、0.6%(2/346)。在74例乙肝组的阳性率分别为18.9%(14/74)、5.4%(4/74)、8.1%(6/74)、13.5%(10/74)、2.7%(2/74)。在74例肝病对照(LDC)组阳性率分别为5.4%(4/74)、2.7%(2/74)、5.4%(4/74)、10.8%(8/74)、0.0%(0/74)。PBC患者的HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性率显著高于HBV患者(χ2=101.3、100.8和11.0,P<0.01)。HBeAg阳性PBC患者的ALT、GGT水平显著高于HBsAg阴性PBC患者CU值分别为1212.0、1074.0,P<0.01)。结论:HBsAg阳性PBC患者水平显著高于阴性患者(U=94.0、P<0.05)。HBeAg与PBC患者肝功能损伤有关,临床筛查HBeAg和HBsAg对PBC诊断有重要意义。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎的临床研究

目的:探讨荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测乙型肝炎的临床价值。方法:应用FQ-PCR技术对1562例乙型肝炎阳性血清标本和无症状健康者血清进行HBV-DNA检测并对不同血清型的HBV-DNA进行比较。结果:经FQ-PCR检测,380例HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率100%;246例HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率88.6%;210例HBsAg(+)、HBeAg(+)其HBV-DNA阳性率98.1%;190例HBsAg(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率69.5%;146例HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率22.6%;66例HBsAb(+)其HBV-DNA阳性率6.1%;20例HBsAb(+)、HBcAb(+)其HBV-DNA阳性率60.0%;18例HBsAb(+)、HBeAb(+)其HBV-DNA阳性率55.5%;286例“两对半”五项全阴性的病例中有4例HBV-DNA阳性,其阳性率为1.4%。结论:血清中HBV-DNA水平反映了体内HBV是否复制及复制的程度,定量PCR是鉴别HBV感染各期有价值的工具,是评价传染性的可靠方法。定量PCR测定灵敏度高,对乙型肝炎的临床诊断、治疗方案的选择和疗效观察有重要意义。     

乙肝HBV DNA荧光定量检测与血清标志物结果相关性分析

目的 研究乙肝血清学标志物（HBV-M）结果与HBV-DNA水平的关系，分析HBV DNA阳性率在各年龄组的分布情况。方法对深圳市部分服务行业人员血清应用荧光定量PCR检测和ELISA法检测并对结果进行分析。结果1781例乙肝血清学标志物阳性血清中有1102例HBV-DNA阳性。其中883例1．3．5阳性（俗称“大三阳”）血清中HBV-DNA的阳性率为96．15％；722例1．4．5阳性（俗称“小三阳”）血清中HBV-DNA的阳性率为24．38％；138例1．5阳性血清中HBV-DNA的阳性率为38．41％；22例1．3阳性血清中HBV-DNA的阳性率为90．91％；11例HBsAg阳性血清中HBV-DNA阳性率为36．36％。结论两种方法检测乙肝标志物有密切的相关性。荧光定量PCR是检测HBV-DNA含量较精确的方法，能正确反映乙肝病毒的复制水平和活跃程度；HBsAg和HBeAg与HBV-DNA含量有着明显的相关关系。     

962例外来工的乙型肝炎表达模式分析

目的了解来东莞工作的外来工的乙肝感染状况，分析其乙型肝炎的表达模式，为乙肝防治提供参考。方法收集了到某院体检的962份外来工的血清，检测乙肝五项：表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）、核心抗体（HBcAb），并对结果进行分析。结果在检测的962人中，HBsAg阳性335人，阳性率34．82％。其中男性受检者527人，HBsAg阳性204人，阳性率38．71％；女性受检者435人，HBsAg阳性131人，阳性率30．11％。乙肝五项标志物全阴者217人，占总受检人数的22．56％。结论必须加强对来莞工作的外来工的乙肝监测，及时为乙肝五项全阴者注射乙肝疫苗，同时加强外来工的健康教育，提高他们的卫生知识水平。     

大理州农村育龄期妇女乙型肝炎血清流行病学调查#br#

目的 了解大理州农村育龄期妇女乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）血清流行病学特征,为预防和控制乙型肝炎提供科学依据。 方法 采用分层整群随机抽样法和随机数字表法选取15~49岁农村育龄妇女2 063例。进行问卷调查和采集血标本,采用酶联免疫吸附试验检测HBV血清学标志物。 结果 2 063例农村育龄期妇女中HBV表面抗原（HBsAg）阳性 45例（2.18%）,表面抗体（HbsAb）阳性734例（35.58%）,核心抗体（HBcAb）阳性243例（11.78%）。HBV血清学标志物检出模式共7种,以易感模式为主（59.38%）。山区育龄期妇女HBcAb阳性率高于非山区,少数民族育龄期妇女HBcAb阳性率高于汉族,差异有统计学意义（P＜0.05）,不同调查地和民族育龄期妇女HBsAg和HBsAb差异均无统计学意义（P＞0.05）。随着年龄的增长,育龄期妇女HBsAg和HBcAb阳性率越高,差异有统计学意义（P＜0.05）,不同年龄育龄期妇女HBsAb阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。有乙型肝炎疫苗免疫史育龄期妇女HBsAg和HBcAb阳性率低于无免疫史者,HBsAb阳性率高于无免疫史者,差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 大理州农村育龄期妇女HBsAg阳性率接近于低流行水平,约60%人群处于HBV易感状态,应加强乙型肝炎防治知识宣传,促进育龄期妇女在孕前接种乙型肝炎疫苗。