基于核酸自动提取仪的FQ-PCR法在人巨细胞病毒核酸定量检测中的临床应用

目的评价基于核酸自动提取仪的实时荧光PCR(FQ-PCR)法在人巨细胞病毒(HCMV)核酸定量检测中的性能。方法取高浓度值的HCMV标准品进行梯度稀释,评价灵敏度;取低值、中值、高值标准品评价精密度;取高浓度的HCMV抗凝血浆梯度稀释验证线性范围;使用HCMV DNA阴性抗凝血浆稀释标准品至最低灵敏度浓度500 copy/ml,验证最低检出限;取高浓度血浆样本和生理盐水,进行交叉污染验证试验。分别用核酸自动提取仪与手工法提取50份血浆标本的HCMV核酸,评价两方法的线性关系。结果灵敏度方面,呈良好的线性关系(r=0. 998)。精密度方面,3个样本的重复性实验CV值均5%。线性范围验证显示在5. 0×102copy/ml～5. 0×107copy/ml时呈现良好的线性关系(r=0. 991,P 0. 05)。实验不存在交叉污染情况。2种核酸提取方法具有良好的相关性。结论基于安普利Anadas9850全自动核酸提取仪的FQ-PCR法在HCMV核酸定量检测中性能良好,能够较好地满足临床检测需求。     

荧光定量PCR仪技术及其在医学中的应用

荧光定量PCR仪技术是一种新的核酸定量技术，该技术在PCR仪反应系统中引入了荧光标记探针，具有可实时监测、高灵敏性，高特异性和高精确性的特点，极大地克服了原有PCR仪技术的不足，扩大了PCR仪的应用范围。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

水体中致病菌富集和核酸提取方法及优化

目的 建立一种灵敏、可靠、快速对水体中致病菌富集和核酸提取的前处理方法，用于水体致病菌荧光定量PCR检测。方法 通过加标准菌株脓肿分枝杆菌、原菌液梯度稀释，采用离心柱法和磁珠法核酸提取试剂盒结合不同滤膜洗脱方式进行核酸提取；采用不同材质、尺寸、数量的击打物质及均质仪循环次数等对核酸提取条件进行优化；所得核酸进行荧光定量PCR检测，比较各方法的提取效率；采用最优提取条件，对加标水样进行荧光定量PCR检测，考察全流程回收率和检出限。结果 采用0.20μm滤膜过滤+7颗大锆珠均质仪循环6次+TIANMicrobe Magnetic Envir-DNA Kit方法回收率最高（81.03%±19.23%），检出限达到6.20 CFU/100 mL。结论 均质仪+TIANMicrobe Magnetic Envir-DNA Kit法更适用于水体中致病菌的富集和核酸提取。     

罗氏Lightcycler PCR仪离心式控温系统原理及常见故障维修

0引言荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是在常规PCR的基础上加入荧光标记探针,把核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起,实现对目的基因的准确定量检测[1]。我院的罗氏Lightcycler荧光定量PCR仪体积小、实验成本低,检测通道为3通道,可装32位孔数的20μL的玻璃毛细管,主要用于病毒的测定及疾病诊断等工作。     

新型冠状病毒实验室核酸检测方法及实践

目的研究新型冠状病毒(2019-nCoV)实验室核酸检测的原理方法,探讨实时荧光定量PCR方法在新型冠状病毒实验室检测中的价值与实验室注意事项。方法采用实时荧光定量PCR方法检测2020年1月23日-2020年2月2日就诊于解放军总医院海南医院发热门诊的患者以及筛查的湖北旅居者的咽拭子,采用实时荧光定量PCR的方法检测新型冠状病毒开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(N)基因。结果共检测的3 824例标本中,阳性病例35例,阳性率0.91%。结论疫情期间对发热门诊患者及湖北旅居者进行2019-nCoV核酸筛查是非常有必要的,实时荧光定量PCR是一种检测2019-nCoV科学可靠的方法,能快速准确地检测待检标本中的2019-nCoV核酸,对监测和控制疫情有重要意义。     

实时荧光定量PCR法在流感病毒暴发疫情病原学检测诊断中的应用

目的对疑似流感病毒患者标本进行病毒核酸检测诊断,探讨实时荧光定量PCR法在流行性感冒检测诊断中的意义。方法采用WHO标准实时荧光定量PCR法对2010年10月本地区采集的8份疑似甲型H1N1流感患者咽拭子标本进行病毒核酸检测。结果 8份咽拭子标本中有6份呈甲型H1N1流感病毒核酸阳性,阳性率75%。结论实时荧光定量PCR法操作相对简单,耗时短,特异性强,灵敏度高,可作为基层疾控中心流感疫情可靠的快速诊断方法。     

一起肠炎沙门菌食物中毒检测分析

目的:应用实时荧光PCR技术对细菌性食物中毒进行快速检测,为食物中毒调查和应急处理提高依据.方法:采集16份相关标本,其中病人肛拭3份、粪便标本1份、呕吐物1份、剩余食物3份、食物加工人员手涂抹液1份和工作台具涂抹液7份,前增菌后,提取核酸,在LightCycler荧光定量PCR仪上利用实时荧光PCR技术进行沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、大肠杆菌0157、副溶血弧菌病原菌的快速检测和筛查,同时进行细菌分离培养,利用Vrr:EK全自动微生物鉴定仪对可疑菌进行生化反应检测,以及进行血清学试验.结果:11份标本沙门菌实时荧光PCR检测阳性,其他细菌荧光PCR检测阴性;该11份荧光.PCR阳性标本分离的菌株经全自动微生物生化鉴定仪鉴定为沙门菌,99%的概率,血清型都为AF、O9、Hg、Hm,为肠炎沙门菌.结论:本次食物中毒由肠炎沙门菌引起的,应大力整顿熟食市场,加强食品卫生管理和宣传健康教育,避免同类事件再次发生.     

进出口水产品中霍乱弧菌的检测与分析

目的监测并分析进出口水产品中的霍乱弧菌。方法采用传统两步增菌,平板划线,分离可疑单菌落,VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪、普通PCR、实时荧光定量PCR和血清凝集试验确认分离菌株。结果从水产品样品分离的菌株全自动微生物鉴定仪鉴定结果相似度达97%,普通PCR和实时荧光定量PCR检测为霍乱弧菌,ctx毒素基因检测为阴性,血清凝集试验为非O1非O139群霍乱弧菌。结论从水产品中检出霍乱弧菌非流行株,但仍需要加强主动监测,预防疫情的暴发。     

一起腺病毒疫情的现场核酸应急检测及经验思考

目的现场采用荧光PCR法对疫区有关人群进行腺病毒核酸定性检测,为腺病毒疫情处置提供快速准确的实验室依据。方法采集疑似感染人员、密接人员鼻咽拭子分泌物标本,应用便携式核酸快速提取仪和磁感应荧光PCR仪快速检测标本中是否存在腺病毒核酸。结果共采集标本1200余份,300余份腺病毒荧光PCR核酸阳性。结论现场荧光PCR检测法能快速准确地检测出腺病毒核酸,迅速甄别腺病毒感染者,为现场疫情防控、临床治疗提供了强力支撑,同时为类似呼吸道疫情防控提供了经验借鉴。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

实时荧光定量PCR技术在食品检验中的应用

实时荧光定量PCR(real-time quantitativepolymerase chain reaction,RQ-PCR)又称荧光定量PCR,1994年由日本科学家Higuchi提出。当时因为想实时地看到PCR反应的整个过程,就在普通PCR仪的基础上配备了一个激发和检测的装置,在PCR反应的退火或延伸阶段检测掺入到双链核酸中EB的含     

一种免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒临床应用价值的评估

目的评估一种全新的免核酸提取的荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的临床应用价值。方法通过随机检测62例临床血清样品,比较免核酸提取和核酸提取两种试剂HBV-DNA扩增结果的一致性、灵敏度和相关性。结果两种HBV-DNA荧光定量试剂阴阳结果符合率为100%;HBV-DNA定量结果无显著差异（t=1.006,P〉0.05）;免核酸提取法不同浓度梯度相关系数r=-0.9999（P〈0.001）;灵敏度为4×102IU/ml,CV〈6%。结论该免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂扩增效率、线性关系和重现性良好,具有潜在的临床应用价值和发展前景。     

一种免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒临床应用价值的评估

目的评估一种全新的免核酸提取的荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的临床应用价值。方法通过随机检测62例临床血清样品,比较免核酸提取和核酸提取两种试剂HBV-DNA扩增结果的一致性、灵敏度和相关性。结果两种HBV-DNA荧光定量试剂阴阳结果符合率为100%;HBV-DNA定量结果无显著差异(t=1.006,P>0.05);免核酸提取法不同浓度梯度相关系数r=-0.9999(P<0.001);灵敏度为4×102IU/ml,CV<6%。结论该免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂扩增效率、线性关系和重现性良好,具有潜在的临床应用价值和发展前景。     

新冠病毒核酸检测关键影响因素分析

目的 分析影响新冠病毒核酸检测结果的各种关键因素，提出改善核酸检测质量的具体措施。方法 选择4个品牌的八联管耗材、4种核酸提取试剂、4种核酸扩增试剂和2个品牌荧光定量PCR仪，用新冠病毒核酸阳性质控品，比较耗材、试剂和仪器对新冠病毒核酸检测结果的影响。结果 4种不同厂家的八联管检测结果 Ct值差异有统计学意义（P<0.05），扩增八联管j的阳性质控品ORF1ab基因、N基因和IC基因的检测Ct值最小，荧光强度值最大。4种不同品牌试剂提取的核酸A260/A280比值差异有统计学意义（P<0.05），其中试剂a提取的核酸纯度最高，ORF1ab基因、N基因和IC基因的检测Ct值最小。4种扩增试剂和2种荧光定量PCR仪搭建的8个检测系统对应的ORF1ab、N和IC基因检测Ct值变异系数（CV）均小于5%，具有较好的批内重复性，其中aft检测系统的变异系数最小，批内重复性最好。结论 实验耗材、提取试剂和扩增试剂均可影响新冠病毒的核酸检测结果，建议尽量选择原厂或大品牌的耗材、提取和扩增试剂；在投入使用前做好技术性验收和性能验证，保证检测结果准确性。     

实时荧光定量PCR在血站核酸检测中的应用效果

目的：观察并分析在血站核酸检测中实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）的应用效果。方法：选取2023年1月～2023年6月17564分无偿献血者样本,都是经过乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体初检和复检都合格的样本,对其进行实时荧光定量PCR的核酸检测。结果：在17564无偿献血者的血液样本中,经过实时荧光定量PCR技术检测,共有25例乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸阳性,0例丙型肝炎病毒核糖核酸和人类免疫缺陷病毒（1型）核糖核酸阳性。在临检中心举行的室间质评中,所有检验结论均正确,得分为100分。结论：在血站核酸检测中采用实时荧光定量PCR技术,可有效减短病毒检测窗口期,有助于血液安全水平的提高。     

国产磁珠核酸自动提取系统对HBV-DNA检测前处理的研究

目的:比较国产磁珠法核酸自动提取系统和传统的沉淀离心提取法提取血清HBV DNA的效果,探讨其应用潜力。方法:以两种方法平行提取50份血清HBV DNA,荧光定量PCR检测其提取核酸的拷贝数及CT值,进行方法对比试验;配制成不同浓度的HBV应用血清,用国产自动提取系统提取HBV DNA,评价方法的灵敏度、重复性及线性范围;向已知浓度的HBV阳性血清中定量加入溶血及脂血的阴性血清,再同样提取HBV DNA,观察方法的抗干扰特性。结果:两种方法平行提取血清HBV DNA,方法对比试验显示无显著差别;国产自动提取系统的重复性良好,定量检测的灵敏度及线性范围与现行方法一致;抗干扰能力强,溶血及脂血等常见干扰物对HBV DNA提取无干扰。结论:国产磁珠法核酸自动提取系统对血清HBV DNA的提取效果良好,操作简单,自动化程度高,重复性好,适宜用于临床HBV DNA检测前处理的核酸提取。     

利用荧光定量PCR快速鉴定炭疽疫情和种群分型

目的应用实时荧光定量PCR技术对2015年陕西炭疽疫情快速鉴定和种群分析。方法对甘泉县炭疽病例水泡液或病灶涂抹物及血液标本进行细菌分离,同时提取核酸进行荧光定量PCR试验。结果从1例病灶涂抹物中分离到1株炭疽芽胞杆菌。在19例病例中检出16例核酸阳性,疫情相关菌株种群确定为A.Br.001/002群。结论炭疽杆菌实时荧光定量PCR可用于炭疽疫情迅速判定,确定病例菌株种群,可克服传统病原培养分离阳性率低,血清学诊断时间长的缺点。     

实时荧光定量PCR模板DNA快速制备的方法建立与应用

实时荧光定量PCR技术于1996年美国AppiedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现PCR从定性到定最的飞跃,而且与常规PCR相比,具有特异性更强、敏感度更高、操作简便快速、可以有效解决常规PCR污染问题等优点[1-2],已广泛应用于突发公共卫生事件应急处置中病原体的检测.提高实时荧光定量PCR的检测速度,服务于突发公共卫生事件应急检测是当前备受关注的技术问题.实时荧光定量PCR由模板制备和PCR两部分组成,缩短模板制备时间就可提高实时荧光定量PCR的检测速度.我们研制了一种模板制备方法,使制备时间从原来的30 min以上缩短至5 min以内,制备效果与经典的煮沸裂解法和先进的柱式核酸提取试剂盒相同,用于实时荧光定量PCR可在15～30 min内完成病原体DNA检测.     

江苏省疾病预防控制中心微生物检验室

微生物检验室是省疾控中心承建“卫生部肠道病原微生物重点实验室”和“江苏省医学重点学科——突发疫情处置高技术平台培育点”的主要科室，负责重大传染病、新发传染病及不明原因疾病的病原检测和诊断技术应用研究。科室业务队伍精干，目前有博士2人，硕士7人。实验设备先进，有电子显微镜、超速离心机、全自动DNA序列分析仪、激光共聚焦显微镜、细胞显微操作系统、流式细胞仪、芯片点样仪和扫描仪、多功能光谱检测仪、荧光定量PCR仪、NASBA核酸扩增检测仪、液相悬浮芯片检测仪、全自动核酸提取仪、多功能血清分析仪、