采样液与核酸提取试剂的匹配性对新型冠状病毒核酸检测结果的影响

目的 分析采样液对新型冠状病毒核酸提取效率的影响，为完善实验室质控措施提供依据。方法 对两批不同品牌采样管（A/B）采集的新型冠状病毒待测标本，分别用两种不同厂家生产的提取试剂（甲/乙）进行核酸提取，用同一品牌的扩增试剂和扩增仪器进行实时荧光RT-PCR检测，分析其检测结果。结果 两种提取试剂对于A采样管的提取效率差异有统计学意义（P<0.05），乙提取试剂阳性检出率高于甲试剂（66.67%vs 20.83%）,ORF1ab平均Ct值低于甲试剂（31.1 vs 38.2）,N基因平均Ct值低于甲试剂（29.9 vs 35.2）。两种提取试剂对于B采样管的提取效率差异不明显（P>0.05）。结论 不同采样管与不同提取试剂匹配效果不同，实验室质量控制中性能验证应加强采样管（液）与提取试剂的匹配性验证。     

液相芯片技术在新冠病毒和流感病毒检测中的应用

目的 建立一种液相芯片检测方法，用于检测新冠病毒和流感病毒。方法 从NCBI数据库分别下载新冠病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒全基因组序列，在保守区域分别设计扩增引物和检测探针，以各病毒标准品质粒为模板，建立多重PCR扩增体系；将核酸探针偶联至荧光编码微球，建立液相芯片检测体系，并对方法进行评价。结果 基于多重PCR和液相芯片技术建立的新冠病毒和流感病毒的检测方法能够同时检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因和S基因，甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NS基因及人类看家基因ACTB基因。检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度为1×10⁴拷贝/反应，甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因的灵敏度为1×10³拷贝/反应；可准确检测新冠病毒N基因、ORF1ab基因和S基因，甲型流感病毒M基因和乙型流感病毒NS基因及人类看家基因ACTB基因片段，没有出现相互干扰的现象。结论 建立的方法能同时检测新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒，可作为新冠病毒及流感病毒感染的诊断及流行病学调查的方法。     

新型冠状病毒肺炎病例痰标本和鼻咽拭子标本病毒核酸检测效果比较

目的比较新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病例的下呼吸道标本(痰)和上呼吸道标本(鼻咽拭子)病毒核酸的检测效果。方法采用实时荧光PCR方法,分别检测5例COVID-19病例同一时间采集的痰标本和鼻咽拭子标本中新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因,并对检测结果进行比较。结果 5例COVID-19病例痰标本核酸检测ORF1ab基因、N基因的CT值低于鼻咽拭子,扩增曲线信号优于鼻咽拭子。结论 COVID-19病例同一时间痰标本病毒载量高于鼻咽拭子标本,核酸检测效果优于鼻咽拭子。     

三种前处理方法对粪便中新型冠状病毒核酸检测结果的影响

目的 对比三种不同前处理方法,为安全、快速、有效的提取粪便标本中新型冠状病毒核酸提供参考。方法 采集20份新型冠状病毒肺炎确诊病例粪便标本,分别用PBS、Trizol、Trizol和PBS三种方法进行前处理,再提取核酸进行实时荧光RT-PCR,比较不同提取方法的检出率。结果 PBS处理标本中,检出12份ORF1ab/N基因阳性/阳性,1份ORF1ab/N基因阴性/阳性,7份ORF1ab/N基因阴性/阴性,检出率为60%;Trizol处理标本中,检出14份ORF1ab/N基因阳性/阳性,6份ORF1ab/N基因阴性/阴性,检出率为70%;Trizol和PBS处理标本中,14份ORF1ab/N基因阳性/阳性,1份ORF1ab/N阴性/阳性,5份ORF1ab/N基因阴性/阴性,检出率为70%。三种前处理方法检出率及Ct值差异无统计学意义（P＞0.05)。结论 采用三种处理方法在不震荡、不离心的情况下均能从粪便标本中检出新型冠状病毒核酸。Trizol处理检出率略高于PBS处理,且Trizol处理可一定程度上降低标本传染性,可作为首选。     

淮南市新型冠状病毒核酸检测结果分析

目的建立新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测方法,比较新型冠状病毒感染肺炎患者上下呼吸道标本核酸检测结果的差异,为临床诊断SARS-CoV-2感染,如何选择标本类型以及提高核酸阳性检出率提供参考。方法采集31例疑似新冠肺炎患者呼吸道标本,采用实时荧光定量RT-PCR方法对新型冠状病毒感染者的咽拭子和痰液标本进行双靶标(ORF1ab基因和N基因)核酸检测,应用卡方检验分析不同类型标本新型冠状病毒核酸阳性率的差异。结果 31份新型冠状病毒病例的咽拭子标本中,26份阳性,5份阴性,阳性率为83.8%;31份痰液标本中,29份阳性,2份阴性,阳性率为93.5%;两种标本检测结果差异无统计学意义(χ~2=1.449,P0.05)。不同发病时间患者咽拭子阳性率和痰液阳性检出率差异均无统计学意义(P=0.669)。比较咽拭子和痰液ORF1ab基因平均CT值(荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数),咽拭子较痰液高3.04; N基因CT值咽拭子较痰液高3.33。1例患者呼吸道标本阴性,肛拭子新冠病毒核酸阳性。结论咽拭子和痰液标本,均可用于SARS-CoV-2核酸检测。痰液ORF1ab基因和N基因CT均值低于咽拭子,更易检出,用于检测SARS-CoV-2更具优势。此外,呼吸道标本核酸检测阴性的患者,进一步检测消化道标本,对患者临床判断和疾病防控具有重要意义。     

新型冠状病毒核酸检测样本DNA污染鉴别方法研究

目的 采用不同实时荧光PCR方法检测各类型DNA污染模拟样本,分析检测方法性能,为在新型冠状病毒(简称新冠病毒)核酸检测中鉴别DNA污染提供依据。 方法 取实验室保存的新冠病毒RNA核酸样本和新冠病毒阳性质控品(含病毒序列的质粒样本),按不同比例混合,并进行梯度稀释,制成模拟样本。分别使用实时荧光RT-PCR、灭活逆转录酶前加样并去除RT步骤的PCR(PCR Set 1)和灭活逆转录酶后加样并去除RT和灭活步骤的PCR(PCR Set 2)三种不同方法,使用同一型号设备对同一批模拟样本进行检测。记录并分析检测结果,确定最佳的DNA污染判断方法。 结果 新冠病毒RNA核酸样本中,相比实时荧光RT-PCR,PCR Set 1下所有样本的Ct值增高2-4个循环,PCR Set 2中除原始样本N基因阳性外,均为阴性。新冠病毒DNA污染样本三种方法检测Ct值无明显差异。含等量DNA污染的混合污染样本和含梯度DNA污染的混合污染样本三种方法检测显示Ct值存在差异。三种方法检测不同新冠病毒基因,变化规律无明显差异。 结论 PCR Set 1和PCR Set 2两种方法均可用于鉴别DNA污染,特别是PCR Set 2方法对各浓度的DNA污染均有较好的区分能力。     

多重组等温聚合酶快速扩增技术在新冠病毒检测中的应用

目的 探讨多重组等温聚合酶快速扩增技术（MIRPA）在新冠病毒检测中的应用价值。方法 从GenBank数据库下载新冠病毒基因核苷酸序列，选取保守区域ORF1ab基因作为扩增对象，设计MIRPA检测的特异性引物。通过引物筛选、反应体系优化，建立检测新冠病毒的MIRPA方法，用建立的MIRPA方法检测人类冠状病毒OC43(HCoVOC43)、HCoV-229E、流感病毒B型（FluB）阳性咽拭子样本，评估其特异性；和实时荧光定量PCR检测结果比较，评估其准确度。结果 针对新冠病毒ORF1ab基因序列设计合成引物和探针，建立MIRPA检测体系。用优化的MIRPA体系检测新冠病毒阳性参考品均为阳性，HCoV-OC43、HCoV-229E、FluB均为阴性；MIRPA方法的灵敏度为100拷贝/ml；和实时荧光定量方法的检测结果符合率达100.00%。结论 建立的MIRPA方法检测新冠病毒的特异性强、灵敏度高，结果准确可靠，具有重要的经济和社会价值。     

15例COVID-19患者治疗后痰、粪便标本新型冠状病毒核酸检测结果比较

 

目的 探讨粪便样本作为疑似或确诊新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者筛查的可行性。方法 利用Real Time RT-PCR技术,对15 例COVID-19患者治疗后痰、粪便标本中新型冠状病毒的ORF1ab、N基因以及人体细胞管家基因核糖核酸酶P（ribonuclease P,RNase P）进行检测,比较痰、粪便标本检测阳性情况。结果 15例患者痰、粪便标本,人体细胞管家基因 RNase P均呈现典型的明显的扩增信号曲线。新型冠状病毒核酸检测,2例患者痰、粪便标本同时为阳性,4例患者痰、粪便标本分别为阳性;6例患者痰阳性标本中有2例同时扩增出ORF 1ab基因与N基因,6例患者粪便阳性标本中有4例同时扩增出ORF 1ab基因与N基因。结论 以呼吸道标本新型冠状病毒核酸检测阴性作为排除COVID-19及治愈标准在实施过程中需谨慎,可以尝试将粪便标本新型冠状病毒核酸检测阴性也纳入其中。

     

324份新冠病毒感染者咽拭子标本qRT-PCR检测结果分析

目的探讨新型冠状病毒(新冠病毒)感染后病毒载量变化规律,比较感染者不同种类标本核酸检测结果一致性。方法以2020年1月21日至2020年3月18日泉州市报告的48例新冠病毒感染者为对象,依据实时荧光定量反转录多聚酶链反应(qRT-PCR)咽拭子核酸检测结果,分为未复阳组29例和复阳组19例,回顾性分析所采集的324份咽拭子标本、55份深咳痰标本及36份肛拭子标本的核酸检测结果。结果未复阳组和复阳组发病到核酸检测CT值达峰值时间间隔分别为(7.1±4.8) d、(6.4±4.8) d,差异无统计学意义;未复阳组在CT值达峰值后病毒载量下降,发病后(20.7±5.7) d连续两次核酸检测阴性;复阳组病毒载量在CT值达峰值后病载下降中反跳出现第二峰,发病后(29.9±6.1) d连续两次核酸检测阴性,时间间隔比未复阳组长(t=-3.84,P0.01);不同种类标本(采集时间、对象相同)核酸检测结果比较显示,咽拭子标本与深咳痰标本检测结果Orf1ab基因一致性差、N基因一致性一般(Kappa值0.00、Kappa值=0.30);咽拭子标本与肛拭子标本检测结果Orf1ab基因一致性较差、N基因一致性一般(Kappa值=0.15、0.29);深咳痰标本两种基因检出率均高于咽拭子标本(配对χ~2值=6.50、15.43,P0.01)。结论新冠病毒感染者中未复阳组与复阳组病程中病毒载量变化峰型不同,且复阳组发病至连续两次核酸检测阴性时间间隔较长,原因有待探究;不同种类标本的核酸检测结果,以N基因结果一致性均略好,深咳痰、咽试子标本基因检出率前者高于后者。     

一种免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒临床应用价值的评估

目的评估一种全新的免核酸提取的荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的临床应用价值。方法通过随机检测62例临床血清样品,比较免核酸提取和核酸提取两种试剂HBV-DNA扩增结果的一致性、灵敏度和相关性。结果两种HBV-DNA荧光定量试剂阴阳结果符合率为100%;HBV-DNA定量结果无显著差异（t=1.006,P〉0.05）;免核酸提取法不同浓度梯度相关系数r=-0.9999（P〈0.001）;灵敏度为4×102IU/ml,CV〈6%。结论该免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂扩增效率、线性关系和重现性良好,具有潜在的临床应用价值和发展前景。     

一种免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒临床应用价值的评估

目的评估一种全新的免核酸提取的荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的临床应用价值。方法通过随机检测62例临床血清样品,比较免核酸提取和核酸提取两种试剂HBV-DNA扩增结果的一致性、灵敏度和相关性。结果两种HBV-DNA荧光定量试剂阴阳结果符合率为100%;HBV-DNA定量结果无显著差异(t=1.006,P>0.05);免核酸提取法不同浓度梯度相关系数r=-0.9999(P<0.001);灵敏度为4×102IU/ml,CV<6%。结论该免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂扩增效率、线性关系和重现性良好,具有潜在的临床应用价值和发展前景。     

新标准下17种新型冠状病毒核酸检测试剂性能比对研究

目的 参照新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）中解除集中隔离和出院核酸检测标准比较17种新型冠状病毒核酸检测试剂的检测性能，为实验室核酸检测选择试剂提供参考。方法 选取2021-08/2022-03新型冠状病毒肺炎疑似病例呼吸道样本50份，经数字聚合酶链式反应（dPCR）检测确定样本阴阳性并对病毒核酸载量定量，再分别对17种检测试剂（编号为A～Q）进行评价。以Ct值35为限值判定检出数和检出率，利用各试剂的检测值做试剂间两两比对分析，对各试剂检检测值和dPCR检测值比对分析Ct值与核酸量的关系，以P<0.05为差异有统计学意义。结果 17种核酸检测试剂中15种试剂检测正常，阴性样本检出率在0%～35%之间，阳性样本检出率在39%～96%之间，各试剂间检出率和检测值均有一定差异且与检测靶标数、试剂检测最低限以及检测模板加入量没有相关性；核酸量在57 360 copies/ml以上各试剂均能检出，且检出能力随核酸量减少出现差异。结论 若检测结果不按照试剂盒说明书中Cut-off值而是按照Ct值35为限值判定，则15种试剂对较高病毒载量的样本均能有效检出，但各试剂的检测性能有一定差异...     

三种核酸提取方法在甲型流感病毒临床样本检测中的效果对比

目的比较三种核酸提取方法在甲型流感临床样本检测中的效果,为优化甲流病毒临床样本检测效果提供依据。方法在三例口岸送检的甲流临床样本的检测中,分别以硅胶膜法、磁珠法和快速法三种方法提取病毒核酸,以商品化荧光RT-PCR试剂盒或实验室自建荧光RT-PCR体系进行甲型流感病毒和流感病毒H3亚型检测。结果商品化试剂盒检测中,用硅胶膜法提取的三份样本均能检出阳性,而快速法提取的核酸仅能在03号样本中检出,在另外两份样本中未能检出。在自建体系检测中,三种方法提取的核酸均能检出甲流病毒阳性,但快速法检测的Ct值明显高于硅胶膜法和磁珠法。结论对于低病毒浓度样本,硅胶膜法和磁珠法提取核酸的效率更高,快速法有漏筛的风险。     

变异新冠病毒对口岸疫情防控影响的快速风险评估

目的评估变异新冠病毒对口岸疫情防控的影响,为有关部门防控新冠肺炎疫情输入提供针对性的建议。方法采用专家会商法研判变异新冠病毒输入我国的风险。疫情信息主要来自世界卫生组织官网。结果变异新冠病毒输入我国的风险高;由于突变集中在S蛋白,对我国的诊断试剂不构成影响,我国目前采用的(ORF1ab、N)双靶标核酸检测试剂可以检出变异株。尽管现有疫苗对变异新冠病毒的保护作用有一定程度降低,但仍然有效,疫苗接种仍是预防变异株感染的最有效措施。结论应加强口岸入境人员中变异新冠病毒的监测力度,密切关注全球疫情进展和国内疫情变化,根据国家疫情防控总体部署适时调整口岸防控策略和措施。     

荧光定量检测法比较三种提取大豆加工样品方法的优劣

运用荧光定量检测的方法，比较了CTAB法、试剂盒法和SDS法提取大豆加工样品的优劣。通过测定其内源基因Lectin得到的Ct值大小比较基因表达水平的高低，通过标准加入法得到标记基因35S和内源基因Lectin Ct值的差值△Ct值，结合标准曲线，计算出每种混合样品中转基因成分的百分含量，进而比较这三种提取方法对PCR反应的抑制程度。总体说来，CTAB法提取大豆加工样品得到的核酸最适合PCR反应，其次是试剂盒法，SDS法稍差。     

新型冠状病毒灭活样品混合进行核酸检测效果分析

目的了解新型冠状病毒灭活样本混合检测对结果的影响,为大人群样本的新型冠状病毒核酸筛查提供科学检测的方案。方法将新型冠状病毒阳性咽拭子样本和阴性咽拭子样本于56℃30min灭活后,按照阳性样本1份、阴性样本4、9、19份的比例进行混合,用实时荧光RT-PCR技术检测原液和混合液的ORF-lab和N基因。结果20组灭活样品原液核酸检测结果全部为阳性,1∶5混合液和1∶10混合液核酸检测结果也均是阳性,1∶20混合液有1组样品ORF-lab阴性,N基因阳性。各组间核酸检测Ct值均显著相关。不同样本组组间阳性率差异无统计学意义。20组样品ORF-lab基因1∶5混合液、1∶10混合液、1∶20混合液相比原液Ct值分别平均增加1.73、2.86、4.05,N基因1∶5混合液、1∶10混合液、1∶20混合液相比原液Ct值分别平均增加1.69、2.79、3.25。结论当开展大人群样本的新型冠状病毒核酸筛查时,选择<10份灭活样品混合检测,大部分情况下不影响定性结果,但弱阳性样本结果可能会受到影响。     

湖南省湘西自治州首例人感染H5N6禽流感病例的实验室诊断

目的:对一例不明原因重症肺炎病例进行H5N6禽流感病毒实验室诊断。方法:采集患者呼吸道标本,利用两种核酸提取方法,使用实时荧光RT-PCR技术进行检测。结果:H5和N6亚型引物的检测结果均为阳性,其中仪器提取法扩增曲线较手工提取法扩增曲线结果典型。结论:为提高H5N6禽流感病毒的检出率,建议在可疑病例使用药物之前,及早采集下呼吸道标本送实验室检测。     

应用TaqMan-BHQ探针实时荧光RT-PCR法定量检测马秋波病毒核酸

〔目的〕建立一种适应口岸马秋波病毒实时荧光定量RT-PCR快速的检测方法。〔方法〕用专业软件设计引物和TaqMan-BHQ探针,以人工合成马秋波病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR研究。〔结果〕模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线为Y=-3.281X+50.975,R2=0.999361,PCR扩增效率为101.0%,其最低检出限为28 copies/μl。〔结论〕应用TaqMan-BHQ1探针的实时荧光RT-PCR检测马秋波病毒核酸,具有耗时短、灵敏度高等特点。     

湖南省湘西自治州首例人感染H5N6禽流感病例的实验室结果分析

目的对一例不明原因重症肺炎病例进行H5N6禽流感病毒实验室诊断。方法采集患者呼吸道标本,利用两种核酸提取方法,使用实时荧光RT-PCR技术进行检测。结果 H5和N6亚型引物的检测结果均为阳性,其中仪器提取法扩增曲线较手工提取法扩增曲线结果典型。结论该病例经实验室检测,为湖南省湘西自治州首例H5N6禽流感病例。为提高H5N6禽流感病毒的检出率,建议在可疑病例使用药物之前,及早采集下呼吸道标本送实验室检测。     

新型冠状病毒实验室核酸检测方法及实践

目的研究新型冠状病毒(2019-nCoV)实验室核酸检测的原理方法,探讨实时荧光定量PCR方法在新型冠状病毒实验室检测中的价值与实验室注意事项。方法采用实时荧光定量PCR方法检测2020年1月23日-2020年2月2日就诊于解放军总医院海南医院发热门诊的患者以及筛查的湖北旅居者的咽拭子,采用实时荧光定量PCR的方法检测新型冠状病毒开放读码框1ab(ORF1ab)、核壳蛋白(N)基因。结果共检测的3 824例标本中,阳性病例35例,阳性率0.91%。结论疫情期间对发热门诊患者及湖北旅居者进行2019-nCoV核酸筛查是非常有必要的,实时荧光定量PCR是一种检测2019-nCoV科学可靠的方法,能快速准确地检测待检标本中的2019-nCoV核酸,对监测和控制疫情有重要意义。