间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的：研究5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导体外骨髓间充质干细胞（marrow measenchymal stem cells，MSCs）向心肌细胞发展的作用及其机制。方法：从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs，培养传代后用不同浓度的5-aza诱导，倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化；流式细胞术检测细胞周期改变；MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响；免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达；RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达。结果：5-aza对MSCs有抑制增殖的作用（P〈0．05）；在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的形态变化；免疫细胞化学检测结果表明，MSCs的经5-aza诱导14d，肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高（P〈0．01）；PT—PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显，而对照组未见表达。结论：MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞，这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关。     

转录因子ZFP580在缺氧预处理抗大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

 目的：通过观察缺氧预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及锌指核转录因子ZFP580表达的改变,探讨ZFP580的作用及机制。方法：培养大鼠H9c2心肌细胞,分为3组：（1） 缺氧/复氧(H/R)组：H9c2心肌细胞换用模拟缺血溶液(pH=6.2)缺氧(95% N2 + 5% CO2)培养3 h,复氧培养2 h;（2） 缺氧预适应(HPC)组：H9c2心肌细胞经3个循环的短暂缺氧(10 min)/复氧(20 min)处理后,进行同上H/R实验;(3) 对照(C)组：正常培养的H9c2心肌细胞。通过MTT染色及LDH水平判定HPC的作用。Western blotting方法观察心肌细胞中转录因子ZFP580表达及ERK1/2磷酸化情况,以及ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059对ZFP580表达的影响。分别构建高/低表达ZFP580的慢病毒载体并转染H9c2心肌细胞,经H/R实验后利用Annexin V-PE/7-AAD染色及流式细胞术检测H9c2细胞凋亡情况,Western bloting方法观察caspase-3活化情况。结果：HPC能显著改善H/R处理后H9c2心肌细胞存活率降低和LDH漏出的现象。Western blotting结果显示,HPC组心肌细胞中ZFP580表达及ERK1/2磷酸化程度较H/R处理组明显上升,且PD98059预处理明显抑制HPC诱导的ZFP580的表达上调。慢病毒介导的基因转染实验发现,ZFP580高表达的H9c2心肌细胞在H/R损伤后凋亡率降低且细胞中活化caspase-3表达下降。结论：HPC可引起心肌细胞中转录因子ZFP580表达上调,ZFP580作为ERK1/2通路的下游靶分子发挥抗心肌细胞凋亡的作用。ZFP580表达上调可能作为内源性保护机制之一介导了HPC的细胞保护作用。     

钠泵抑制剂哇巴因对ECV304细胞连接相关分子表达的影响

目的:探讨钠泵抑制剂哇巴因对细胞连接相关分子表达的影响.方法:以不同浓度哇巴因作用ECV304细胞,用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态变化;通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长抑制作用;用Hoechst33342/PI双荧光染色、荧光显微镜分析细胞死亡特征;应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞连接相关分子钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白、 P120连环蛋白1A和P120连环蛋白3A mRNA的表达.结果:哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长;10 μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死;0.1 μmol/L哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、边移、凋亡小体形成等凋亡特征.RT-PCR结果显示钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白和P120连环蛋白1A表达下降,P120连环蛋白3A表达上调.结论:哇巴因调节ECV304细胞连接相关分子表达从而影响其黏附和存活.     

Na~+/K~+-ATP酶α1亚单位小干扰RNA和哇巴因诱导肝癌HepG2细胞S期阻滞及其机制

目的 观察哇巴因联合Na~+/K~+-ATP酶(钠泵)α1亚单位小干扰RNA(siRNA)对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响.方法 分析人肝癌临床组织标本、正常肝组织和肝癌细胞系SMC7721、Bel7402和HepG2细胞钠泵α1亚单位的表达.CCK-8法检测采用钠泵α1亚单位siRNA和哇巴因作用肝癌HepG2细胞增殖抑制状况,分析各组细胞的钠泵活性变化,流式细胞术分析细胞周期变化.实时定量PCR和蛋白质印迹法检测钠泵α1、促分裂源活化蛋白激酶1(MAPK1)、细胞围期蛋白1(CyclinA)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白抑制因子(P21~(WSF1))表达的变化.结果 肝癌组织标本的钠泵α1亚单位密度值(174.7±16.8)明显高于正常肝组织(65.3±7.9,P<0.05);HepG2细胞钠泵α1亚单位表达明显高SMMC-7721和Bel-7402细胞(P<0.05).siRNA、哇巴因和联合用药可抑制HepG2细胞的增殖,联合实验组效果更显著(P<0.05),0.03μmol/L siRNA组、0.1 μmol/L哇巴因和联合实验组细胞24、48和72 h抑制率分别为17.4%、20.3%、24.3%,37.5%、44.3%、51.2%,52.3%、70.2%、88.2%.各实验组均出现钠泵活性降低,以联合实验组最显著(P<0.05).0.1 μmol/哇巴因和联合实验组HepG2细胞S期比例从24.2%上升至66.5%和75.2%;实时定量PCR和蛋白质印迹检测显示哇巴因组和联合实验组P21<'WAF1>表达上调而钠泵μ1亚单位、MAPK1、CyclinA、CDK2和PCNA表达下调.结论 钠泵α1亚单位siRNA联合哇巴因抑制HepG2细胞钠泵后可抑制细胞增殖,而P21~(WAF1)表达上调和CyclinA/CDK2/PCNA周期调控复合体生成减少可能是引起S期阻滞的主要原因.     

四种检测细胞凋亡方法的比较

目的评价四种检测细胞凋亡的方法.方法以蟾蜍素(bufalin)诱导的白血病细胞株HL60细胞凋亡,选择流式细胞术(FCM)、原位缺口末端标记法(TUNEL)、DNA电泳和电镜(EM)技术对比检测细胞凋亡.结果定性的EM和DNA电泳技术可靠,而TUNEL和FCM主要用于定量检测.结论EM、TUNEL和FCM检测细胞凋亡率具有显著相关性.     

微丝在体外培养四种不同细胞表达的形态观察

【目的】探讨微丝在4种不同细胞内的形态分布。【方法】体外培养人胃低分化粘液腺癌(MGC80 3)细胞系、人肝癌(SMMC772 1)细胞系、原代培养人皮肤成纤维细胞(HSF)和大鼠骨髓间充质干细胞(MSC) ;用考马斯亮蓝显示四种细胞内的微丝,通过光学显微镜观察微丝分布的状态。【结果】MGC80 3细胞系和人肝癌SMMC772 1细胞系内,微丝较细且均匀分布,原代培养的HSF和MSC细胞内微丝较为粗大,分布不均匀。【结论】微丝分布与细胞的粘附状态和细胞形态有密切关系。     

哇巴因诱导ECV304细胞凋亡与p120ctn mRNA的表达

目的研究哇巴因对ECV304细胞的作用及相关机制。方法应用MTT法检测哇巴因对细胞生长抑制作用,Hoechst33342/PI双荧光染色分析细胞死亡特征,透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化,半定量RT-PCR法检测P120ctn 1A和P120ctn 3A mRNA的表达。结果哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长;荧光显微镜下可见30%以上细胞为凋亡细胞,20%细胞为晚期凋亡细胞的形态学改变;透射电镜下可见核染色质凝集、边移、凋亡小体形成等细胞形态学变化;RT-PCR结果显示P120ctn 1A mRNA表达较对照组明显降低,P120ctn 3A mRNA表达较对照组明显增强。结论哇巴因能抑制ECV304细胞增殖和诱导其凋亡,并下调P120ctn 1A和上调P120ctn3A mRNA表达。     

蟾蜍灵对白血病小鼠脾脏的保护作用

目的 :研究蟾蜍灵对白血病小鼠脾脏系数的影响 ,探讨其增强机体免疫功能的机制。方法 :建立小鼠L72 12白血病模型 ,以蟾蜍灵腹腔注射给药 ,1次 /d ,连续 7d ,于第 8d将小鼠处死 ,计算脾脏系数。结果 :实验组与对照组小鼠相比差异显著 ,实验组小鼠脾脏系数明显减小 (t检验 ,t =3 70 ,P <0 0 1)。结论 :蟾蜍灵对L72 12白血病小鼠的脾脏具有一定的保护作用     

蟾蜍灵对K562细胞生长抑制及凋亡诱导作用

目的：研究中药蟾酥有效成分蟾蜍灵(bufalin)对人白血病细胞的作用。方法：应用MTT比色法观察bufalin对细胞的抑制作用，用荧光双染观察细胞结构的改变，DNA凝胶电泳分析细胞的凋亡。结果：bufalin明显抑制K562细胞的生长，半数抑制浓度(IC50)约为0．0125μmol／L；0．10μmol／L的bufalin作用24h即可明显诱导白血病细胞的凋亡，凋亡率呈剂量和时间依赖性；琼脂糖凝胶电泳检测到DNA梯带。结论：bufalin对白血病细胞有极强的生长抑制和诱导凋亡作用。     

从噬茵体7肽库中筛选畦巴因特异性结合的短肽

以哇巴因为靶分子,从噬菌体7肽库中筛选与哇巴因特异性结合的短肽.经过3轮淘筛并通过ELISA法鉴定,获得14个阳性克隆,通过对噬菌体ssDNA电泳鉴定和序列分析筛选得到3种短肽:肽A、B和C的筛选一致率分别为64.3%(9/14),28.6%(4/14)和7.14%(1/14).Genbank中蛋白质同源性分析显示,肽A、B、C均不与钠泵蛋白同源.放射性配基受体结合法检测结果表明,合成的肽A能够与哇巴因结合.哇巴因特异性结合短肽的获得将为阻遏内源性哇巴因与钠泵的结合、防治高血压奠定基础.