四种检测细胞凋亡方法的比较

目的 评价四种检测细胞凋亡的方法。方法 以蟾蜍素（bufalin)诱导的白血病细胞株HL60细胞凋亡,选择流式细胞术（FCM）、原位缺口末端标记法（TUNEL）、DNA电泳和电镜（EM）技术对比检测细胞凋亡。结果 定性的EM和DNA电泳技术可靠,而TUNEL和FCM主要用于定量检测。结论 EM、TUNEL和FCM检测细胞凋亡率具有显著相关性。     

短暂局灶性脑缺血再灌注条件下细胞凋亡与坏死动态变化的特异性评价

目的:研究末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)、DNA聚合酶I介导的生物素标记的(dATP)缺口平移PANT在检测短暂大脑中动脉缺血再灌注细胞凋亡与坏死方面的特异性。方法:采用TUNEL,PANT和苏木精-伊红染色方法,检测短暂大脑中动脉缺血30min再灌注不同时间点,前囟水平冠状平面组织切片DNA损伤,采用DNA琼脂糖凝胶电泳,检测细胞核DNA的损伤。结果:大脑中动脉缺血30min以及再灌注2h,DNA琼脂糖凝胶电泳检测到,缺血侧呈细胞坏死特征性条带;苏木精-伊红染色证实纹状体有坏死细胞;但在缺血30min,TUNEL和PANT检测不到阳性细胞。再灌注2h,出现PANT阳性细胞,但邻片TUNEL阳性细胞无增加。再灌注24h,TUNEL,PANT阳性细胞都呈凋亡特征性改变。结论:在短暂局灶性脑缺血再灌注条件下,①再灌注早期,TUNEL和PANT都不标记坏死细胞。②再灌注早期TUNEL不标记DNA单链断裂。③再灌注24h,PANT可标记发生凋亡的单链损伤细胞。④在短暂局灶性脑缺血模型,TUNEL检测细胞凋亡以及PANT检测细胞核DNA单链断裂特异性高。     

三氧化二砷体外诱导宫颈癌细胞株凋亡及其机制的研究

目的:研究三氧化二砷体外能否诱导宫颈癌细胞株(HeLa细胞)发生凋亡及其相关机制。方法:采用透射电镜、DNA Ladder、TUNEL的方法进行凋亡检测,用ECL Westernblot的方法检测凋亡过程中相关基因表达的变化。结果:三氧化二砷体外作用于HeLa细胞后,透射电镜观察到了凋亡小体;DNA Ladder法检测到了凋亡时DNA降解形成的梯带;TUNEL法也检测到HeLa细胞有DNA的断裂。在凋亡过程中,凋亡相关基因bcl-2的表达下调,而p53基因的表达没有明显改变。结论:三氧化二砷体外能诱导HeLa细胞发生凋亡,其机制与bcl-2基因的表达下调有关。     

氨肽酶抑制剂Bestatin通过激活半胱天冬酶3诱导HL-60细胞凋亡

目的 研究半胱天冬酶3在国产氨肽酶N抑制剂Bestatin(商品名百士欣,BS）诱导人白血病细胞凋亡过程中的变化及其意义。方法 用光学显微镜观察细胞形态结构的改变,通过DNA片段原位末端标记法及流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡。用发色底物法检测细胞半胱天冬酶3活性。Rhodamin(Rh)123染色后,采用FCM检测细胞线粒体跨膜电位。结果 典型的细胞形态改变、DNA片段化、DNA末端原位标记及FCM结果,均证实BS能诱导HL－60细胞凋亡。凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖关系。BS诱导细胞凋亡过程中,半胱天冬酶3活性明显升高,而AC0DEVD－CHO能抑制BS诱导的细胞凋亡。经BS处理的HL－60细胞出现线粒体跨膜电位（ΔΨm)下降。结论 BS通过激活半胱天冬酶3而诱导白血病细胞凋亡。     

RNA干扰表皮生长因子受体对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA载体介导抑制骨肉瘤细胞中表皮生长因子受体(EGFR)的表达和对骨肉瘤细胞增殖与凋亡的影响.方法:构建pSilencer-EGFR短发夹状小干扰RNA(siRNA)真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到骨肉瘤细胞中,用Western印迹法、RT-PCR检测EGFR基因在骨肉瘤细胞中的表达;通过原位末端标记 (TUNEL)法,DNA片段化检测观察其对骨肉瘤细胞凋亡的影响.结果:成功构建pSilencer-EGFR短发夹状siRNA真核基因表达载体,转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的骨肉瘤细胞中EGFR基因表达显著抑制(60%).与对照组比较,pSilencer-EGFR转染组骨肉瘤细胞培养 48 h后,DNA片段化检测出"DNA ladder"和TUNEL法显示细胞典型凋亡特征.结论:EGFR小发夹RNA质粒载体可显著抑制骨肉瘤细胞中EGFR基因的表达,促进骨肉瘤细胞凋亡,EGFR基因具有抑制凋亡的作用.     

去铁胺激活半胱天冬酶3诱导HL-60凋亡

为了研究铁螯合剂-去铁胺（deferoxamine,DFO）诱导人白血病细胞株HL-60凋亡时半胱天冬酶-3（caspase-3）活性的变化并探讨DFO诱导凋亡的可能机制.HL-60细胞经HE染色,在光学显微镜下观察其形态结构变化,用TUNEL法和流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡,免疫组织化学法检测caspase-3活性,原位杂交法检测凋亡基因bax的转录水平.结果表明,HL-60经去铁胺处理后,典型的细胞形态改变、DNA末端原位标记和FCM检测均证实DFO可诱导细胞凋亡,凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性.在DFO诱导HL-60凋亡过程中,caspase-3活性明显升高,凋亡基因bax的转录水平均较对照组增高（P＜0.05）.caspase广谱抑制剂Z-AVD可明显降低DFO诱导的细胞凋亡率.结论：DFO通过激活caspase-3和增强bax活性而诱导HL-60凋亡.     

DPA法检测细胞凋亡及其在白血病中的应用

目的建立一种检测白血病细胞凋亡的新方法。方法高速离心将DNA样品区分为小分子量DNA片段及高分子量DNA(分别来自凋亡和未凋亡细胞)两部分,二苯胺(DPA)法测定各部分DNA含量,计算DNA片段率,从而分析细胞凋亡情况。以此方法分析了白血病细胞株HL-60受不同剂量抗癌药物VP-16诱导时的凋亡情况。结果与FCM法相比,各剂量组细胞凋亡率无显著差别(P＞0.05),经密度梯度离心法分离提取的凋亡细胞,两种方法测得细胞凋亡率亦无明显差别(P＞0.05)。结论二苯胺法测定DNA片段是分析白血病细胞凋亡的一种简单有效方法。     

超声辐照载羟喜树碱微泡对肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

目的 探讨超声辐照载羟喜树碱微泡对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖抑制作用.方法 将SMMC-7721细胞随机分为6组,即载羟喜树碱微泡+超声组、羟喜树碱+超声组、单纯羟喜树碱组、载羟喜树碱微泡组、空白微泡+超声组及对照组.采用MTT法观察各处理因素对细胞的生长抑制情况;流式细胞仪(FCM)分析细胞周期分布;Annexin V-FITC/PI双染法和TUNEL法检测细胞凋亡状况.结果 载羟喜树碱微泡+超声组对肝癌细胞株SMMC-7721的增殖有明显抑制作用,其24 h、48 h、72 h的抑制率分别为(49.56±1.57)%,(80.01±1.52)%,(91.41±0.64)%;FCM结果显示其将SMMC-7721细胞有效阻滞于G0/G1期;Annexin V-FITC/PI检测细胞早期凋亡率为(12.18±1.38)%;TUNEL法显示染成棕黄色的凋亡细胞,细胞中晚期凋亡率为(34.25±1.83)%.以上结果与其他组的检测结果相比,差异有统计学意义.结论 超声辐照载羟喜树碱微泡能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖.其机制可能与阻滞细胞周期于G0/G1期同时诱导细胞凋亡有关.     

宫颈鳞癌患者组织自发性凋亡和辐射诱导凋亡与放疗疗效的关系

目的探讨宫颈鳞癌患者组织细胞自发凋亡和放疗 10 Gy后辐射诱导的凋亡与放疗疗效的关系 , 快速确定宫颈鳞癌的辐射敏感性 , 为肿瘤放射治疗方案的个体化提供理论依据 . 方法采用核酸电泳和 TUNEL方法检测宫颈癌活检组织中细胞凋亡水平 . 结合病人接受根治性放疗后的疗效 , 分析细胞凋亡指数与放疗疗效的关系 . 结果核酸电泳 , 在放疗后的宫颈癌组织出现典型的 DNA梯状带 (DNA ladder). TUNEL标记发现 , 照射前宫颈癌组织存在较低的细胞凋亡指数 , 但与其放疗的疗效具有相关性 ; 放疗 10 Gy后凋亡指数 (AI10)明显增加 (P     

细胞凋亡DNA检测技术概况

细胞凋亡一个最直观的指标就是染色体DNA的变化，故以检测DNA来监测细胞调亡是细胞凋亡实验室检测中的重要内容。本文综述了目前常见的几种细胞凋亡DNA检测方法，有琼脂糖凝胶电泳法，原位TUNEL法，ELISA法及流式细胞仪和光散射法。其中原位TUNEL法常用于细胞凋亡与相关基因表达间关系的研究，ELISA法常用于有关体外细胞增殖、生长调节与凋亡关系方面的研究，上述两种方法具较高灵敏度和特异性，是目前检测细胞凋亡较常用的手段。     

蒿甲醚对K562细胞作用的体外实验研究

目的:探讨蒿甲醚对人慢性髓性白血病细胞K562体外增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法:采用四甲基偶氮唑蓝(简称MTT)法测定不同浓度蒿甲醚对K562细胞生长抑制作用.计算半数抑制浓度(IC50);流式细胞术DNA含量分析检测蒿甲醚对K562细胞周期的影响,流式细胞仪TUNEL法检测蒿甲醚对K562细胞凋亡的作用.结果:蒿甲醚可以抑制K562细胞增殖,经药物作用24、48、72 h后,IC50分别为(32.27±0.15)、(27.48±0.08)、(25.00±0.37)μg/mL;流式细胞术DNA含量分析结果显示蒿甲醚作用后,G2/M期细胞增多;流式细胞术TUNEL法显示蒿甲醚作用后K562细胞凋亡率和坏死率均高于对照组.结论:蒿甲醚可以抑制人慢性髓性白血病细胞株K562细胞增殖、影响细胞周期、诱导肿瘤细胞的凋亡.     

短暂局灶性脑缺血再灌注条件下细胞凋亡与坏死动态变化的特异性评价

目的：研究末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL），DNA聚合酶Ⅰ介导的生物素标记的(dATP)缺口平移PANT在检测短暂大脑中动脉缺血再灌注细胞凋亡与坏死方面的特异性。方法：采用TUNEL，PANT和苏木精-伊红染色方法，检测短暂大脑中动脉缺血30min再灌注不同时间点，前囟水平冠状平面组织切片DNA损伤，采用DNA琼脂糖凝胶电泳，检测细胞核DNA的损伤。结果：大脑中动脉缺血30min以及再灌注2h，DNA琼脂糖凝胶电泳检测到，缺血侧呈细胞坏死特征性条带；苏木精-伊红染色证实纹状体有坏死细胞；但在缺血30min，TUNEI和PANT检测不到阳性细胞。再灌注2h，出现PANT阳性细胞，但邻片TUNEL阳性细胞无增加。再灌注24h，TUNEL，PANT用性细胞都呈凋亡特征性改变。结论：在短暂局灶性脑缺血再灌注条件下，①再灌注早期，TUNEL和PANT都不标记坏死细胞。②再灌注早期TUNEL不标记DNA单链断裂。③再灌注24h，PANT可标记发生凋亡的单链损伤细胞。④在短暂局灶性脑缺血横型．TUNEL检测细胞凋亡以及PANT检测细胞核DNA单链断裂特异性高。     

华蟾素对Jurkat细胞株的体外作用和动物实验研究

目的:通过体外实验和动物实验,探索华蟾素对白血病细胞株的作用。方法:通过四氮唑蓝(MTT)比色法、Hoechst荧光染色法、原位末端标记(TUNEL)法、DNA凝胶电泳及流式细胞术(FCM)观察华蟾素对人白血病细胞株Jurkat的增殖、细胞凋亡、bcl-2表达的影响;在DBA/2小鼠的腹腔中注射L1210细胞,比较治疗组和对照组小鼠的生存期,评价药物疗效。结果:与对照组相比,1∶100～1∶25浓度的华蟾素能明显抑制Jurkat细胞生长,Hoechst荧光染色可见典型的凋亡形态学改变,TUNEL可见深棕色凋亡细胞,DNA电泳出现凋亡特有的“梯子”式条带,AnnexinV/PI双染色的FCM也证实凋亡的存在。在经1∶100、1∶50、1∶25浓度的华蟾素处理2d后,细胞凋亡率分别为18.78%、24.40%和40.29%。凋亡细胞的bcl-2表达由44.07%下调至16.30%。动物实验中,L1210白血病腹水瘤小鼠经华蟾素治疗后,生存期延长35.90%。结论:华蟾素能抑制Jurkat细胞生长并诱导凋亡,可能是通过下调bcl-2的表达来实现。动物实验证实,华蟾素能延长L1210白血病腹水瘤小鼠的生存期。     

介入化疗对宫颈癌细胞凋亡的影响

目的 :探讨介入化疗对宫颈癌细胞凋亡的影响。方法 :取正常宫颈组、宫颈癌组介入化疗前和介入化疗后各2 0例的宫颈组织标本 ,采用DNA缺口原位末端标记法 (TUNEL)进行细胞凋亡的检测 ,用凋亡指数 (AI)表示结果。结果 :宫颈癌组介入化疗前的AI( 5 .2± 1.19% )、介入化疗后的AI值     

拓朴替康诱导K562细胞凋亡时p38MAPK的变化

目的:探讨拓朴替康诱导K562细胞凋亡的相关信号转导途径。方法:0.1μmol/L的拓朴替康处理K562细胞24h时,通过流式细胞仪(FCM)和片段DNA含量检测研究拓朴替康对靶细胞的促凋亡活性;采用免疫印迹法和γ-32P掺入法测定拓朴替康对p38MAPK含量及其活性的影响。结果:FCM检测发现在K562细胞周期图中出现一凋亡峰,凋亡细胞比率为16.9%,凋亡细胞特有的片段DNA含量为(45.9±1.0)%;p38MAPK含量及其活性明显升高,分别为对照组的4.9倍和4.1倍。结论:拓朴替康诱导K562细胞凋亡可能通过激活p38MAPK来实现。     

重组腺病毒表达的融合蛋白SH2-caspase 8对K562细胞凋亡的影响

摘要:目的：研究表达融合蛋白SH2-caspase 8的重组腺病毒AdE-SH2-caspase 8-HA-GFP（SC）对BCR/ABL阳性的慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的影响。 方法：将重组的腺病毒SC转染K562细胞(SC组),分别设突变AdE-SH2m-caspase 8-HA-GFP(SmC)组、病毒空载体AdEGFP(CMV)组和PBS对照组。用荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测病毒转染效率,western blot检测融合蛋白及凋亡相关蛋白caspase 3、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）的表达情况,用光学显微镜观察经瑞氏染色后的细胞形态,FCM和DNA梯度电泳检测细胞凋亡情况。 结果：FCM和荧光显微镜检查结果显示,重组腺病毒在K562细胞中的转染效率较高;融合蛋白SH2-caspase 8-HA和SH2m-caspase 8-HA可在K562细胞中表达;瑞氏染色后SC组出现明显的凋亡形态改变;FCM检测结果表明, SC组与SmC组、CMV组和PBS组相比较,其早期凋亡细胞明显增高（t分别为6.945、19.083和16.470,P均<0.05）,DNA梯度电泳检测结果发现SC组和SmC组可出现细胞凋亡特异性的梯度条带,western blot结果表明,SC组和SmC组凋亡相关蛋白caspase 3、PARP活化片段的表达水平升高。 结论：重组腺病毒SC表达的SH2-caspase 8融合蛋白能明显诱导K562细胞的凋亡。     

紫杉醇-抗HER2MAb偶联物体外抗肿瘤活性的研究

目的研究紫杉醇(Paclitaxel,TAX)与抗HER2(Human epidermal growth factor receptor2,表皮生长因子受体2)单克隆抗体(MAb)偶联物(TAX-抗HER2MAb)体外抗肿瘤作用。方法实验细胞为MCF-7乳癌细胞,MTT法检测细胞增殖抑制作用,进行统计学分析;FCM检测细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳分析凋亡细胞基因组DNA;Western-blot检测细胞HER2蛋白表达水平。结果在相同药物浓度下偶联物对肿瘤细胞抑制率明显高于TAX,具有统计学意义(P0.05);半数抑制率药物浓度(IC50)相差20%,具有统计学意义(P0.05);FCM和琼脂糖凝胶电泳DNA检测分析,偶联物作用的细胞凋亡效果明显高于TAX,Western-blot检测出偶联物作用的肿瘤细胞HER2蛋白表达量明显降低。结论 TAX-抗HER2MAb偶联物体外抗肿瘤作用明显高于TAX。     

重组腺病毒AdE-SH2-Caspase8对耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响

目的:研究表达融合蛋白SH2-Caspase 8的重组腺病毒Ad E-SH2-Caspase 8-HA-GFP(SC)对BCR/ABL阳性的耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响。方法:K562/G01细胞经重组的腺病毒SC感染后,分别设突变Ad E-SH2m-Caspase 8-HA-GFP(Sm C)组、病毒空载Ad EGFP(CM V)组和PBS对照组。荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测病毒感染效率,Western blot检测融合蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达水平,光学显微镜观察经瑞氏染色后的细胞形态,FCM和DNA梯度电泳检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3和PARP的表达水平。结果:重组腺病毒在K562/G01细胞中的感染效率较高;Western blot能检测到目的蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达;与对照组比较,瑞氏染色后SC组出现明显的凋亡形态改变,FCM检测结果表明SC组早前凋亡细胞明显增高(P0.05),DNA梯度电泳检测结果发现SC组出现明显细胞凋亡特异性的梯度条带,Western blot结果表明SC组凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP活化片段的表达水平升高。结论:重组腺病毒SC表达的SH2-Caspase 8融合蛋白能明显诱导K562/G01细胞的凋亡。     

肢体缺血再灌注后肝损伤中细胞凋亡的发生及牛磺酸的保护效应

目的 观察大鼠肢体缺血再灌注(LIR)后肝损伤和肝脏细胞凋亡情况及其发生机制,并探讨牛磺酸的保护效应.方法 实验采用Wistar大鼠30只,建立大鼠LIR损伤模型,随机分为对照组、缺血再灌注(IR)组和牛磺酸+缺血再灌注(TR)组,每组10只.分别测定各组大鼠肝组织丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)及Ca2+含量的改变;利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯状条带,利用TUNEL法检测各组肝脏细胞的凋亡情况.HE染色观察肝脏形态学变化.结果 与对照组比较,IR组大鼠肝组织MDA、XOD、MPO、Ca2+含量均明显升高(P均<0.01),肝脏细胞DNA琼脂糖凝胶电泳可见梯状条带;TUNEL染色结果 显示凋亡百分率明显升高(P<0.01).与IR组相比,TR组血浆和肝组织中MDA、XOD、Ca2+含量和MPO反均有所下降(P<0.01或<0.05),肝脏细胞DNA琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带不明显;凋亡百分率降低(P<0.01).结论 细胞凋亡参与了大鼠LIR后肝损伤的发生,而牛磺酸可减轻大鼠UR所致肝脏损伤及细胞凋亡的发生.     

5-杂氮-2''-脱氧胞苷对宫颈癌细胞生长及其甲基化转移酶和甲基结合蛋白DNA转录的影响

目的:检测5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对体外培养的宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基化转移酶(DNMT)及甲基CpG结合蛋白(MeCP)的DNA转录水平的影响,探索其对肿瘤细胞生长的抑制作用.方法:5-Aza-CdR(终浓度为5.0umol·L-1)与肿瘤细胞共培养72 h后,用PI染色及流式细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞的细胞周期;利用qRT-PCR鉴定药物组与空白组细胞DNMT及MeCP的mRNA浓度.吖啶橙(AO)细胞荧光染色法鉴定药物组与空白组细胞形态学上的差异及凋亡的程度.结果:FCM检测结果显示两组肿瘤细胞的细胞周期呈现明显差异,并且药物组细胞表现为G0/G1期阻滞,sub-G1峰明显.AO染色表明药物组细胞有明显凋亡迹象且伴随少量的细胞坏死现象.qRT-PCR结果显示,空白对照组和药物组中均有一定量DNMT及MeCP的mRNA产物,但其mRNA表达量无显著差异(P>0.05).结论:5-Aza-CdR能够诱导体外培养的HeLa肿瘤细胞凋亡,而对于肿瘤细胞中甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的DNA转录无显著的影响.