5-氮胞苷诱导间质干细胞为心肌细胞的实验研究

分离SD大鼠下肢骨，培养获得骨髓间质干细胞（MSCs），经5-氮胞苷（5-aza）定向诱导24h后t用免疫细胞化学法检测诱导细胞对连接蛋白43和α横纹肌肌动蛋白的表达，用逆转录-聚合酶链反应鉴定心肌细胞特异性蛋白的表达情况。结果显示，MSCs经5-aza诱导后，细胞形态不规则；3周后5-aza 10μm组细胞连接蛋白43、α横纹肌肌动蛋白阳性表达；RT-PCR显示细胞表达心肌肌钙蛋白Ⅰ、α心肌肌动蛋白。提示5-aza可体外诱导MSCs分化为心肌细胞，用于心肌梗死的治疗。     

骨髓间质干细胞体外诱导为心肌细胞的实验研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)体外诱导分化为心肌细胞的可行性,为心肌梗死治疗提供理想的细胞材料。方法:分离大鼠下肢骨获取MSCs进行培养;5-氮胞苷(5-aza)诱导24h后继续培养;免疫细胞化学检测细胞对连接蛋白-43和α横纹肌肌动蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步了解心肌细胞特异性蛋白的表达。结果:MSCs经5-aza诱导后,细胞形态不规则;诱导后3周10μmol/L 5-aza组细胞连接蛋白-43、α横纹肌肌动蛋白表达阳性。RT-PCR显示10μmol/L 5-aza诱导后3周的细胞可表达心肌肌钙蛋白I、α心肌肌动蛋白。结论:MSCs体外经5-aza诱导后可分化为心肌细胞。     

诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 观察乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB 、5-氮胞苷(5-aza)及SalB联合5-aza体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.方法 分离培养及鉴定大鼠MSCs,培养乳鼠心肌细胞,收集条件培养液对其进行分组诱导:①SalB(终浓度为250 μg/L),②5-aza组(终浓度为10 μg/L),③SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L),④乳鼠心肌细胞条件培养液,⑤未加诱导剂的阴性对照组.选取MSCs进行诱导,诱导周期为4 w.倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4 mRNA的相对表达量.结果 细胞形态学显示,诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示,诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组和条件培养液两组蛋白表达较低,SalB联合5-aza组蛋白表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示除阴性对照组外,其他四组表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他三组.结论 SalB联合5-aza诱导MSCs表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT;上调心肌早期基因NKX2.5、GATA-4mRNA的表达,证实其能够向心肌细胞分化能力;条件培养液不能上调心肌细胞的早期基因和蛋白,不能诱导其分化.     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

骨髓间(充)质干细胞体外定向诱导心肌样细胞超微结构特征研究

目的：研究兔骨髓间（充）质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）经5～氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导在体外定向分化的心肌样细胞超微结构特征。方法：取兔髂骨骨髓，分离并培养骨髓MSC，用5～aza定向诱导向心肌样细胞分化。以相差显微镜、透射电镜观察心肌样钏胞形态学变化及超微结构特征。结果：5-aza诱导后，部分细胞体积增大，呈“捧状”或“珠状”结构，有肌管样结构形成，透射电镜下见有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微等结构。结论：经5-氮杂胞苷诱导分化的骨髓间（充）质干细胞具有心肌样细胞超微结构特征．     

丹酚酸B在大鼠骨髓间充质干细胞分化过程对心肌早期基因mRNA表达的影响

目的 探讨丹参单体丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的情况及Nkx2.5、GATA-4、Desmin和α-actin mRNA的表达,确定大鼠 MSCs 体外诱导为心肌样细胞的条件、规律及转化细胞的特点.方法 选用成年近交系Wistar大鼠,利用percoll分离液进行密度梯度离心法和直接贴壁法进行分离、提纯 MSCs,并进行培养扩增.免疫组化方法对第9代MSCs表面抗原进行鉴定.分别应用10 μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)及250 mg/L SalB联合5-aza(5-aza+SalB)对第9代的MSCs进行联合诱导24 h,于诱导后第4周,用实时荧光定量RT-PCR法检测Nkx2.5、GATA-4、Desmin和α-actin的基因表达.结果 ①第9代MSCs免疫组化染色CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达.②诱导4 w后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构.5-aza组、5-aza+SalB组均出现明确的心肌早期分化基因;与5-aza组相比,5-aza+SalB组的Nkx2.5、GATA-4、Desmin 和α-actin mRNA的表达明显增强.结论 SalB具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用,并且在Nkx2.5基因表达上SalB的优势更加明显.     

不同浓度5-氮胞苷对小鼠骨髓间充质干细胞的诱导作用

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的最佳诱导浓度。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传第2代MSCs培养48h后分别加入3、5、10、20、50μmol／L5-aza进行诱导,设为3、5、10、20、50μmol／L组。继续培养3周后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测心肌特异性蛋白α-actin表达。结果5-aza3、5μmol／L组α-actin阳性率分别为0．88％±0．52％、2．61％±0．96％,两组细胞形态均无明显改变;10μmol／L组可见细胞突起回缩,α-actin呈强阳性表达,阳性率为30．57％±1．82％;20、50μmol／L组细胞已脱落。结论MSCs经5-aza体外诱导分化,可获得形态类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞,且以10μmol/L浓度诱导作用最佳。     

复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的能力。方法采用全骨髓直接贴壁的方法分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第四代MSCs,应用免疫细胞化学法、原位杂交组织化学法、透射电子显微镜鉴定心肌样细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性,CD34、CD45、CD31阴性。经复方丹参滴丸含药血清诱导向心肌样细胞分化后,免疫细胞化学法显示α辅肌动蛋白(α-Actinin)、结蛋白(desmin)强阳性,原位杂交组织化学法显示肌球蛋白重链(MHC)强阳性表达。结论复方丹参滴丸含药血清能促使MSCs分化为心肌样细胞,为中药干预MSCs治疗缺血性心脏病提供干细胞实验依据。     

5-氮胞苷对培养兔骨髓基质细胞心房利钠肽表达的影响

目的研究5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外培养兔骨髓基质细胞中心肌特异性心房利钠肽(atrialnatriureticpolypeptide,ANP)表达的影响,探讨骨髓基质细胞向心肌样细胞分化的条件。方法体外分离培养兔骨髓基质细胞用不同浓度5-aza诱导培养,以RT-PCR方法测定诱导前后ANP的表达。结果正常培养兔骨髓基质细胞不表达ANP。经5-aza诱导并继续培养24h后,骨髓基质细胞表达ANP,在一定时间、浓度范围内ANP含量逐渐增加。结论5-aza诱导体外培养兔骨髓基质细胞表达心肌特异性ANP,与诱导时间及浓度呈正相关,提示可诱导兔骨髓基质细胞向心肌样细胞分化。     

骨髓间充质细胞修复心肌梗死的影响因素研究

目的探讨心肌梗死后自体骨髓间充质细胞（MSCs）心肌内移植减轻心功能不全的可能性，以及体外诱导及注射部位等因素对移植疗效的影响。方法34只新西兰白兔均经过骨穿抽取骨髓，开胸建立心梗模型，MSCs体外培养和二次开胸心肌内注射等操作，按照对其MSCs的处理方式和心肌内注射的成分不同随机分为三组：A组为MSCs未经体外诱导；B组为MSCs经5．氮杂胞苷（5-aza）体外诱导；C组为对照组，注射生理盐水。另外根据注射部位不同分为疤痕组和边缘组。结果与未诱导的MSCs相比，5-aza诱导的MSCs移植并未表现出更多的优越性。注射的部位是心功能改善关键的影响因素。如果注射到疤痕区，MSCs更倾向于分化为成纤维细胞。如果注射到边缘区，MSCs则倾向于分化为心肌细胞。结论在进行MSCs心肌内移植时不仅要强调将MSCs投送到梗死区，更要注意将MSCs投送到尚有存活心肌的边缘区。     

重组腺相关病毒介导人血管内皮生长因子165基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨以腺相关病毒(rAAV)为血管内皮细胞生长因子165基因(VEGIF165)载体,在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究其相关特性。方法 (1)全骨髓培养法提取培养MSCs,利用免疫组化法检测MSCs表面标志CD34、CD44;流式细胞分析法检测CD90。(2)rAAV-VEGF165转染MSCs,采用ELISA及PCR检测VEGF的表达,比较转染前后细胞的变化情况,观察VEGF165基因转染对MSCs的影响。结果 (1)成功培养出MSCs,CD44阳性表达,CD34阴性表达,CD90阳性表达。(2)在转染rAAV-VEGF165后转染组上清中VFGF165分泌水平明显高于未转染组(p<0.05),5 d时达到高峰,此后表达开始下降。琼脂糖凝胶电泳可见高亮度条带。表明rAAv-VEGF165成功转染进MSCs细胞中,绘制生长曲线,显示rAAV-VEGF165基因转染后对MSC生长无影响。结论rAAV-VEGF表达载体可有效感染MSCs,并在体外高效表达,为MSCs联合基因治疗提供了实验依据。     

培养基血清浓度对5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的影响

目的 观察脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌样细胞诱导分化的适宜培养基血清浓度。方法采用Ⅰ型胶原酶消化法自成人脂肪组织分离ADMSCs进行培养。对第3代细胞以10μmol／L的5-氮胞苷（5-aza）诱导作用24h,用含10％、5％胎牛血清的完全培养基继续培养,镜下观察细胞形态学变化,采用免疫细胞化学染色鉴定心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）,计算心肌细胞转化率,采用RT—PCR方法检测NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结果5-aza诱导ADMSCs后7d细胞形态及排列开始发生变化,4周后可见极个别细胞出现细微搏动,10％、5％胎牛血清培养下心肌样细胞转化率分别为31．5％±4．2％、32．8％±5．0％,P=0．72;RT-PCR产物条带见NKX2．5、GATA4及cTnⅠ基因表达。结论ADMSCs在-aza诱导后于低浓度血清培养基中培养效果更好。     

丁酸钠和5-aza诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（sodiumbutyrate）和DNA甲基化抑制剂5-aza对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌细胞分化的影响。方法常规培养大鼠BMSCs,细胞分为4组：依次加入丁酸钠0mM,0.5mM,1.0raM,2.0mM。MTT和流式细胞仪检测不同浓度丁酸钠对细胞增殖和凋亡的影响。4周后利用western blot和免疫荧光检测4组细胞的心肌细胞特异性蛋白的表达。从上述4组中选出诱导能力最强的丁酸钠组与5-aza组成4个实验组：阴性对照组,5-aza组,丁酸钠组,5-aza.L丁酸钠组。作用4周后检测心肌细胞特异性蛋白的表达。结果丁酸钠抑制细胞增殖,具有浓度依赖性,而对细胞凋亡没有明显影响。检测发现丁酸钠和5-a．za均能有效诱导BMSCs分化为心肌细胞,丁酸钠诱导分化最适浓度为1.0mM。同时1．0mM丁酸钠诱导分化效率高于5-aza。除此,5-aza和丁酸钠共同作用于BMSCs,其诱导分化能力明显高于其它组。结论丁酸钠能够有效诱导BMSCs向心肌细胞分化,丁酸钠浓度为1．0mM时诱导能力最强,同时诱导分化率高于5-aza。5-aza和丁酸钠一起作用诱导BMSCs向心肌细胞分化的能力明显高于其它组,间接证明DNA去甲基化和组蛋白乙酰化具有协同作用。丁酸钠在有效作用浓度范围内,虽然抑制BMSCs增殖,但是不影响细胞凋亡,表明丁酸钠具有低毒的特性,为以后丁酸钠应用于临床打下实验基础。     

骨髓源性内皮祖细胞与内皮细胞共培养促进其向成熟内皮细胞分化的研究

目的：探讨共培养的内皮细胞对内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化的影响。方法：分离1～2个月龄,SD大鼠股骨髓,个核细胞（MNCs）,MNCs,Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染鉴定内皮细胞的特性。应用贴块法培养大鼠腹主动脉的内皮细胞,vWF免疫组化染色进行鉴定。采用Transwell培养板,上、下室分别加入内皮祖细胞和内皮细胞,15%胎牛血清的NO.2 DMEM/F12培养液培养14 d,倒置相差显微镜观察培养内皮祖细胞的形态。RT-PCR检测eNOS、vWF mRNA,流式细胞术检测CD31及KDR的表达。结果：荧光双染显示培养的单个核细胞具有内皮祖细胞特性;共培养的内皮祖细胞呈短梭型、铺路石状,培养至4 w时有复杂的网状结构形成。RT-PCR检测显示,eNOS及vWF mRNA表达均较对照组显著增加（P〈0.05）。流式细胞术分析表明,共培养组的内皮祖细胞CD31及KDR的表达,也显著高于对照组（分别为P〈0.05及P〈0.01）。结论：与内皮细胞共培养可促进内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化。     

辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞黏附的不同影响

目的：观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞（SPC）和内皮祖细胞（EPC）黏附的影响,筛选新一代用于包被洗脱支架的药物。方法：采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,重悬于SPC培养基或EPC培养基,接种在纤维连接素包被的培养板,以平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,以激光共聚焦显微镜鉴定的异硫氰酸荧光素-荆豆凝集素-Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL）双染阳性细胞为正在分化的EPC。分别收集培养8 d的SPC和EPC,加入不同浓度辛伐他汀（0,0.01,0.1,1,10μmol/L）培养24 h。采用贴壁法检测SPC和EPC黏附能力。结果：辛伐他汀显著抑制SPC黏附,0.01μmol/L辛伐他汀作用24h,黏附SPC数量较对照组（0μmol/L）明显减少[（52±4）个∶（59±5）个,n=5,P〈0.05]。与SPC相反,辛伐他汀显著促进EPC黏附,其促进作用随辛伐他汀浓度升高而明显增加,1.0μmol/L达最大效应,与对照组相比显著增加[（39±5）个∶（12±3）个,n=5,P〈0.01]。结论：辛伐他汀选择性抑制平滑肌祖细胞黏附,促进内皮祖细胞黏附,其双向调节作用呈浓度依赖性,局部应用有促进损伤血管再内皮化和抑制新内膜过度增生的可能。     

Differentiation of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells to Myogenic Cells and Expression of VEGF After Gene Transfection

INTRODUCTIONOriginally identified as a source of osteoprogenitorcells, mesenchymal stem cells (MSCs) coulddifferentiate to adipocytes, chondrocytes, osteoblastsand myoblasts in vitro and undergo differentiation invivo[1], making these stem cells promising candidates formesodermal defect repair and disease management.MSCs have been proposed as an alternative source forthe regeneration of myocardium. There were severalclinical studies of MSCs' effects on ischemic heartdisease[2]. However…     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的: 研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSC）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法: 采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200 ml/L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSC,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSC 24 h后继续培养。培养4周,用免疫细胞化学染色法检测肌系标记抗原:α-肌动蛋白（α-actin）及心肌细胞特异性标记抗原:肌钙蛋白T（cTnT）;在透射电镜下观察细胞的超微结构。结果: MSC经5-Aza诱导分化后,可表达α-actin和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSC中均未见表达。透射电镜可观察到肌丝等心肌细胞的特异性结构。结论: 5-Aza可诱导MSC分化为心肌样细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的基因表达

目的:观察5-氮胞苷(5-aza)在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)、α-骨骼肌动蛋白(α-skeletal actin)、肌球蛋白轻链-2v(MLC-2v)、锌指结构转录因子(GATA-4)和心脏特异同源转录因子(Nkx2.5)基因表达。方法:取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞细胞表面抗原进行测定。应用10μmol/L5-aza对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h,于诱导后1,2,3及4周,用反转录-聚合酶链反应检测ANP、BNP、α-skeletal actin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45。以5-aza诱导培养24 h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于2端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。诱导组细胞ANP、BNP、α-skeletal actin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论:5-aza可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间,并可能具有心肌细胞的功能。