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[目的 ]构建Nelin基因N端片段的原核表达载体并表达此蛋白 .[方法 ]设计带有BamHI/EcoRI酶切位点的引物 ,以已构建好的质粒pGEX 5X Nelin为模板 ,用PCR扩增Nelin基因N端片段 ,并用BamHI/EcoRI酶切PCR产物和原核表达载体 pGEX 5X 1,然后用T4DNA连接酶将其连接 ,得到重组表达质粒 pGEX 5X Nelin 1,经双酶切鉴定和测序验证 .重组表达质粒转化大肠杆菌BL 2 1,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,以SDS PAGE进行分析 .[结果 ]成功构建并表达了分子量约为 43KD的NelinN端片段的融合蛋白 .[结论 ]所表达的蛋白为蛋白纯化、抗体制备及研究其功能奠定了基础 相似文献
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应用Northern印迹分析技术测定了正常人主动脉平滑肌细胞血小板源性生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)及其受体mRNA的表达,以探讨其与动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)发生的关系。结果显示,正常动脉壁及有脂纹脂斑动脉的正常区PDGF链mRNA仅有微量表达,未检出PDGF受体mRNA的表达;而脂纹脂斑区的PDGFA链mRNA及PDGFβ-受体mRNA表达则显著增高。提示动脉壁PDGFA链及PDGF受体mRNA表达增高与As的发生有关。 相似文献
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血管紧张素Ⅱ促高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖机制的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本工作以培养的正常血压WKY大鼠主动脉平滑肌细胞(ASMC)为对照,探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对培养的SHR ASMC促增殖的机制.结果表明:AngⅡ(10~(-9)~10~(-6)mol/L)对SHR和WKY大鼠的ASMC均有促增殖作用且随剂量增加其作用加强,但对SHR ASMC的促增殖效应明显高于WKY大鼠.应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(A-bFGF)和反义bFGF mR-NA均可明显抑制AngⅡ促SHR ASMC的增殖效应.此外,基础状态下及AngⅡ(10~(-6)mol/L)刺激8h后,SHR ASMC的bFGF基因表达均明显高于WKY大鼠.提示,AngⅡ的促细胞增殖作用部分是通过先诱发bFGF的产生而引起. 相似文献
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目的:研究共表达胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)双自杀基因对大鼠血管平滑肌细胞的杀伤机制.方法:将表达CD和(或)TK的单、双自杀基因重组腺病毒载体分为4组即Ad-EF1α-CD组、Ad-CMV-TK组、Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-lacZ组.感染原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,感染复数为20.给予相应的前体药物5-氟胞嘧啶和脱氧鸟苷后,用四甲基偶氮挫盐微量酶反应比色法(MTI)和流式细胞术分析细胞死亡率.荧光染料Hoechst 33342核染色观察凋亡细胞.琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)的降解.结果:血管平滑肌细胞可被重组腺病毒有效感染(70%).MTF检测发现Ad-EF1α-CD-CMV-TK组双自杀基因及其前体药物[5-氟胞嘧啶(30μg/ml)和脱氧鸟苷(0.3μg/ml)]的细胞毒效应可达91%,高于Ad-CMV-TK组(68%)和Ad-EF1α-CD组(63%)单自杀基因组.流式细胞仪分析Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的杀伤作用是以细胞毒性坏死和凋亡为主.凋亡细胞荧光染色显示Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-CMV-TK组细胞的凋亡率分别为11.0%和12.0%,高于Ad-CMV-LacZ组(1.2%)和Ad-EF1α-CD组(5.0%).琼脂糖凝胶电泳发现在Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的基因组DNA可见到梯样条带.结论:CD/TK双自杀基因对血管平滑肌细胞的杀伤作用大于CD或TK单自杀基因;其杀伤机制是以诱导细胞的坏死和凋亡为主. 相似文献
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培养的自发性高血压大鼠(SHR)及其对照WKY大鼠的主动脉平滑肌细胞(ASMC)能合成和分泌心钠素(ANF)。SHR的ASMC合成和分泌的ANF量分别为0.81±0.05和0.40±0.03ng/106cells,而WKY大鼠为1.00±0.07和0.70±0.03ng/106cells,前者明显低于后者(P<0.01)。应用RT-PCR方法检出ASMC中存在特异的ANFmRNA.10-11~10-5mol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能明显刺激ANF的合成和释放,有量效关系。结果提出:(1)ANF可在ASMC中原位合成。(2)SHR的ASMC合成和分泌ANF量下降及AngⅡ刺激下其ANFmRNA表达降低可能在高血压发生的血管机制中起作用。 相似文献
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应用Northern印迹分析技术测定了正常人主动脉平滑肌细胞血小板源性生长因子及其受体mRNA的表达,以探其与动脉样硬化发生的关系,结果显示,正常动脉壁及有脂纹脂斑动脉的正常区PDGF链mRNA仅有微量表达,未检出PDGF受体mRNA的表达;而脂纹脂斑区的PDGFA链mRNA及PDGFβ-受体mRNA表达则显著增高,提示动脉壁PDGFA链及受体mRNA表达增高与As的发生有关。 相似文献
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寻找差异表达基因 总被引:1,自引:0,他引:1
在现代医学及分子生物学研究中 ,证实、分离、鉴定差异表达基因有着极其广泛的应用。发现差异表达基因 ,有助于阐明疾病发生的分子机制、临床诊断及预后的预测 ;并是基因药物和基因治疗发展的基础。然而 ,当前克隆、鉴定差异表达基因的技术中 ,仅少数几种技术利用了人类及模式生物基因组研究业已取得的成就。其中 ,基因表达的系列分析 (serialanaly sisofgeneexpression ,SAGE)、cDNA微点阵 (cDNAmicroarrays)和综合性基因鉴定程序 (integratedprocedureforgeneidentification ,IP GI)等方法将会变得更为有利。本文将简述近年来用于寻找差异表达基因的几种主要技术 ,并对其趋势作一展望。 相似文献
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应用酵母双杂交系统筛选与新基因nelin相互作用的蛋白质 总被引:1,自引:1,他引:0
目的通过筛选能够与新基因nelin的心肌特异表达产物相互作用的蛋白质从而揭示nelin的生物功能。方法构建表达nelin阅读框全长的诱饵质粒并利用酵母双杂交系统筛选人心脏cDNA文库,以寻找与nelin蛋白发生相互作用的蛋白质。并利用生物信息学方法对筛选得到的蛋白质进行功能结构域分析。结果筛选得到3个蛋白质分别为肌联蛋白(Titin)N2B亚型,细丝蛋白(Filamin)C亚型即γ-Filamin和α胰蛋白酶抑制物重链前体(inter-alpha trypsin inhibitor heavy chain precursor,ITIH)。对这3种蛋白的C末端结构域进行分析发现Titin和Filamin均含有免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain)。结论实验结果揭示了新基因nelin很可能表达一个细胞骨架相关蛋白,它可通过其蛋白质的C末端同Titin和Filamin的免疫球蛋白样结构域发生相互作用而参与细胞骨架网络的形成。 相似文献
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高盐饮食与高血压发病有密切关系,但两者间的病因联系尚未肯定。为研究此问题,需先了解高血压人群中食物盐入量的实况。一般是测定24小时尿钠排量,但它只能反映当日情况,尚难反映盐入量的一般水平。鉴于普查时多次收集24小时尿液有困难,可否用一次或固定时间留尿测钠以反映钠盐摄入量的水平。为此,我们选择20名健康男性进行了尿钠及尿醛固酮的测定。材料及方法(一)检查对象 20名健康男性均为本院职工。平均38岁(30~50岁),自由饮食,正常活动。(二)方法分段留尿:24小时中分段留尿4次,8时至20时每4小时一次,20时至8时一次.24小时尿量为4次之和。测定于冬春季进行。严格控制留尿时间,三个月内每人各收集6天;测定方法:钠和钾用火焰光度计测定。肌酐用傅林-吴氏法测定。醛固酮用放射免疫分析法测定;测验结果进行统计学分析。 相似文献