应用BSP克隆测序检测肝细胞癌组织中Dynamin 3基因启动子区域甲基化水平

目的检测原发性肝细胞癌组织Dynamin 3(DNM3)基因启动子区域36个CpG的甲基化水平,分析其与肝细胞癌患者临床病理特征的关系,探讨DNM3基因甲基化在肝癌形成过程中的作用。方法提取30对患者肝细胞癌组织和癌旁组织DNA,经亚硫酸氢盐处理后,进行巢式PCR并联合克隆测序检测DNM3基因的甲基化水平。结果肝细胞癌患者的甲基化事件发生率为83.3%(25/30)。癌组织的DNM3基因启动子区域平均甲基化率为37.8%,癌旁组织为12.0%,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。DNM3基因甲基化诊断肝癌的受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积(AUC)为0.831,对肝癌有较好的诊断价值。结论 DNM3作为肝细胞癌的一种抑癌基因,其启动子区域高度甲基化可能会促进肝细胞癌的形成。     

全自动测序仪PCR产物测序影响因素研究

目的对影响ABI3500xl全自动测序仪测序过程的因素进行研究,以提高测序的准确度和成功率并降低成本。方法对PCR反应体系、产物纯化方法进行优化。将Big Dye分别稀释8、16和32倍进行测序PCR反应,比较不同的Big Dye稀释倍数对PCR产物测序结果的影响;使用CENTRI-SEP柱纯化法、Big Dye Cleaning Beads磁珠法和乙醇乙酸钠EDTA法对测序PCR产物进行纯化,比较不同纯化方法对测序结果的影响。结果 Big Dye稀释8倍和16倍时,PCR反应体系的测序结果正常,而稀释32倍时测序结果出现碱基误读;3种不同的测序PCR产物纯化方法均可得到满意的测序结果。相比之下,CENTRI-SEP Kit纯化方法所需时间最短(0.5 h),但是成本较高;乙醇乙酸钠EDTA纯化方法成本最低,但耗时较长(2 h);磁珠纯化法所需时间(1 h)和成本介于CENTRI-SEP Kit法和乙醇乙酸钠EDTA法之间,但不适于高通量操作。结论 ABI3500xl全自动测序仪测序过程中,Big Dye稀释16倍时所得测序结果准确且成本较低;3种测序PCR产物纯化方法均可得到准确的测序结果 ,实际工作中应根据操作者具备的实验条件选择最适纯化方法 ,以减少测序时间和成本。     

KAP1在食管鳞癌中的表达及意义

目的 研究KRAB相关蛋白1(KAP1)在食管鳞癌(ESCC)中的表达及意义。方法 选取手术切除的原发性ESCC136例、高级别上皮瘤变(HGIN)35例、低级别上皮瘤变(LGIN)29例和距肿瘤边缘5cm以上的正常食管黏膜组织(NEE)37例，采用免疫组化SP法对以上各组织中KAP1蛋白的表达情况进行检测，分析其与ESCC肿瘤发生发展及患者预后的相关性；采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)对20例匹配的ESCC和NEE组织中KAP1基因的表达进行检测。结果 ①KAP1蛋白的表达从NEE (24.3%)、LGIN(31.0%)、HGIN(45.7%)及ESCC(55.9%)呈逐渐增高趋势，差异均具有统计学意义(P=0.002)；②KAP1的异常表达与pTNM分期、浸润深度及淋巴结转移相关(P<0.05)；③qRT-PCR结果显示，与配对的NEE组织相比，ESCC组织中KAP1的相对表达量明显升高(P<0.01)；④136例ESCC患者的5年总体生存率为13.2%。ESCC患者的5年生存率与组织学分级、pTNM、浸润深度、淋巴结转移等具有相关性(P<0.05)，KAP1的表达与ESCC患者的预后不相关。结论 KAP1的过表达在ESCC的发生、发展和转移中起重要作用，可作为理想的肿瘤标志物辅助ESCC 诊断、指导临床治疗。     

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。     

酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性髓性白血病耐药机制及处理策略

临床上经典药物酪氨酸激酶抑制剂(TKI)为治疗慢性髓性白血病开辟了新途径,可以改善患者临床治疗效果及预后,甚至与同年龄段健康人生存年龄没有差异。它是通过不同通路、细胞分子诱导细胞凋亡从而治疗白血病。随着药物治疗过程及病情进展,耐药事件时有发生,耐药的发生主要与BCR-ABL1点突变及BCR-ABL基因扩增有关。不同突变导致不同耐药水平、临床结局各异。分析目前慢性髓性白血病耐药机制及治疗策略,早期选择靶向药物TKI、联合用药优化治疗方案,避免耐药发生,为改善患者预后,延长生存期,提高生活质量提供一个思路。     

基于实时荧光定量PCR技术的当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量测定方法的开发及比较

目的:对当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的变化情况进行定量分析。方法:建立了实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR),对不同产地、不同收集企业、不同储藏时间当归饮片中金黄色葡萄球菌进行定量分析。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10μL,正向引物、反向引物(10μmol·L~(-1))各0.8μL,模板/基因组DNA 1μL,双蒸水7.4μL。荧光定量反应条件为①扩增曲线:94℃预变性30 s,94℃变性10 s,60℃退火12 s,72℃延伸30 s,循环45次,72℃单点检测信号;②熔解曲线:72℃开始检测,以0.5℃为台阶温度停留15 s采集荧光。根据Real-time PCR的测定结果,分别从生当归、酒当归和土炒当归中选择具有代表性的样品进行平板计数法测定,并与Real-time PCR检测结果进行比较。结果:不同炮制品中金黄色葡萄球菌含量排序为生当归土炒当归酒当归;在不同产地的当归饮片中均以甘肃渭源地区样品所含的金黄色葡萄球菌含量为最低;与零售企业相比,生产销售企业的生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量较低;不同储藏时间对生当归和酒当归中金黄色葡萄球菌含量有一定的影响,随储藏时间的增加,金黄色葡萄球菌的含量增加。对部分代表性样品进行检测时发现,平板计数法检测结果数量级较Real-time PCR低3～4个数量级。结论:建立的Real-time PCR的特异性、灵敏度、准确性以及报告周期均优于平板计数法,可为当归不同炮制品中金黄色葡萄球菌的快速、准确定量检测提供有效技术手段。     

一腓骨肌萎缩症家系临床及基因分析

目的分析一腓骨肌萎缩症家系的临床表现及不同基因检测方法的特点。方法收集一CMT家系8名成员临床资料,并应用等位基因特异性PCR-双酶切方法及多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)检测PMP22基因突变情况,同时选择60名性别、年龄无明显差异的健康人做为对照组。结果该家系中患病者以行走不稳、跨阈步态,伴有弓形足为主要临床表现。该家系中5名成员经等位基因特异性PCR-双酶切及MLPA方法均检测出PMP22基因重复序列,其中出现临床症状的有4名(Ⅱ3、Ⅱ9、Ⅱ11、Ⅲ7),未出现临床症状但基因检测结果示PMP22基因重复序列的为携带者有1名(Ⅲ5),家系中余3名成员及对照组60名均未见重复序列。结论基因检测在明确CMT诊断中起重要作用,且MLPA法筛查基因时操作更简便、灵敏度更高、特异性更好。     

《世界华人消化杂志》参考文献要求

本刊采用“顺序编码制”的著录方法,即以文中出现顺序用阿拉伯数字编号排序.提倡对国内同行近年已发表的相关研究论文给予充分的反映,并在文内引用处右上角加方括号注明角码.文中如列作者姓名,则需在“Pang等”的右上角注角码号;若正文中仅引用某文献中的论述,则在该论述的句末右上角注码号.如马连生[1]报告……,研究[2-5]认为……;PCR方法敏感性高[6,7].