一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

TaqMan PCR技术同步检测沙眼衣原体及肺炎衣原体的DNA

我们自行设计了针对沙眼衣原体、肺炎衣原体的特异性引物、Taq Man荧光探针,对这2种病原体核酸进行双重扩增荧光探针杂交检测,取得满意结果。     

舍格伦综合征患者口腔白色念珠菌耐药性与基因型的研究

目的:研究舍格伦综合征(Sjgren'ssyndrome,SS)患者口腔分离白色念珠菌株对氟康唑敏感性与基因型之间的相关性。方法:对分离自SS患者的30株口腔白色念珠菌株行微量稀释法药物敏感性试验。分别用RSD10、RSD11和RSD123种引物对药物敏感性不同的菌株进行随机扩增DNA多态性(RAPD)分析。结果:SS患者口腔分离的白色念珠菌中氟康唑耐药株与敏感株均显示出基因型的多态性,对氟康唑敏感性不同的白色念珠菌株之间的RAPD带型未见差异。结论:SS患者口腔白色念珠菌耐药现象的产生可能与药物诱导有关,而并非遗传基础所致。     

实时定量PCR检测氟对软骨细胞COLⅨA3基因表达的影响

目的:探讨氟对体外培养软骨细胞中COLⅨA3基因mRNA的表达影响。方法:采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行实时定量PCR的方法,检测不同剂量氟对体外培养软骨细胞中COLⅨA3基因mRNA的表达影响,染氟剂量分别为0、5、10、20、40mg/L,染氟10d。结果:实时定量PCR检测显示各组均可检测到COLⅨA3mRNA,相对定量比由对照组到高剂量组约为:100:134:200:104:129,染氟实验组中5mg/L、10mg/L组表达量高于对照组和40mg/L组,且以10mg/L组表达量最高,是对照组的2倍。随着染氟剂量增加,软骨细胞COLⅨA3基因mRNA表达量降低。结论:不同剂量氟对软骨细胞中COLⅨA3基因mRNA表达的影响不同,低剂量氟可以促进COLⅨA3基因mRNA的表达,随剂量增加氟的促进作用减弱。     

实时定量PCR分析脂肪酸合酶在口腔鳞癌中的表达

目的利用实时定量PCR(RT-PCR)相对定量脂肪酸合酶(FAS)在口腔鳞癌、癌周以及正常口腔组织中的表达情况。方法切取口腔鳞癌患者新鲜手术标本的癌组织、癌周组织及正常组织，将组织切剪成碎块，提取细胞总RNA，经寡聚脱氧胸腺嘧啶逆转录，实时定量PCR扩增，针对内参照GAPDH基因相对定量FAS的表达，比较FAS在3种组织中的表达。结果 FAS在癌组织中高表达，19例患者癌组织中的FAS mRNA表达水平皆高于正常组织，最高达16倍Go<0．001)。13例癌旁组织表达水平较正常组织高Go<0．001)。结论 口腔鳞癌组织和正常组织中的FAS表达有显著差异。实时定量PCR方法简便、快速、高效，并能相对定量内源性脂肪酸合酶在口腔鳞癌组织中的表达。     

口腔白斑和鳞癌组织中ems1基因扩增的临床意义

目的:探讨em s1基因在口腔白斑和口腔鳞癌组织中扩增的临床意义。方法:采用显微解剖和差示PCR方法在15例正常口腔黏膜组织,30例口腔白斑组织和33例口腔鳞癌组织中检测em s1扩增,Logistic回归分析其与患者临床病理参数之间的相关关系。结果:em s1扩增与口腔鳞癌原发肿瘤大小T分级(P=0.025)、分化程度(P=0.043)、淋巴结状态(P=0.015)、临床分期(P=0.038)有显著相关性。结论:有em s1扩增的口腔鳞癌患者其预后可能较差,提示em s1扩增对OSCC预后有一定的预测价值。     

牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化过程中基因表达研究

目的：分离培养来源于人成体牙髓组织的干细胞(dental pulp stem cells，DPSC)，分析研究其在未分化状态及在矿化诱导液中基因表型的变化：方法：采用胶原酶消化法获得人牙髓组织的单细胞悬液，14 d后挑取细胞克隆，分别在普通培养基和矿化诱导培养基中进行培养，利用RT-PCR，图像分析检测细胞基因表型变化。结果。未诱导的DPSC不表达牙本质特异性蛋白(dentin phosphprotein,DSPP)及骨涎蛋白(Bone sialoprotein，BSP)，表达部分成骨(osteocalcin,OCN alkaline phsphatase,ALP)相关表型，低表达转录因子核心结合因子(Cbfa-1)；与末诱导的DPSCs相比较，在成骨诱导中DPSCs表达DSPP和BSP，骨相关基因表达也相应上调。结论：DPsCs在矿化诱导液的作用下向成牙本质样细胞分化，其过程有可能是通过谱系特异表犁的表达或表达上调实现的。     

聚合酶链反应在牙周可疑病原微生物检测中的应用

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)已广泛应用于致病微生物的检测。本文对应用 PCR检测牙周可疑致病菌的种类以及PCR的特异性、敏感性、多重PCR、定量PCR在牙周病原微生物检测中的应用进行了综述。     

牙周致病菌在冠心病患者龈下菌斑中的分布

目的:分析牙周致病菌在冠心病患者龈下菌斑中的分布情况,及冠心病患者龈下菌斑中牙周致病菌的分布与慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)病变程度之间的关系。方法:收集44例患冠心病并伴有CP患者的龈下菌斑,采用Chelex-100法提取细菌DNA,以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)、伴放线菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans,Ha)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fn)、中间普氏菌(Prevotella intermedia,Pi)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythensis,Tf)五种牙周炎相关致病菌。结果:44例冠心病患者的龈下菌斑中各牙周致病菌的检出率分别为:Pg 19(43.18%)、Ha 9(20.45%)、Pi 27(61.36%)、Fn 38(86.36%)、Tf 41(93.18%);轻度CP患者1例,Fn 1例(100%);中度CP患9例,其中Pg6(66.67%)、Ha 2(22.22%)、Pi 7(77.78%)、Fn 9(100%)、Tf 8(88.89%);重度CP患者34例,其中Pg13(38.24%)、Ha 7(20.59%)、Pi 20(58.82%)、Fn 28(82.35%)、Tf 33(97%)。结论:Tf、Fn可能在冠心病的发生发展中起着重要作用,冠心病患者中CP的发病和进展可能有其特定的细菌学病因。     

人牙胚釉原蛋白成熟肽基因的克隆

目的:克隆人釉原蛋白成熟肽编码区基因片断,并构建含有该基因的重组表达质粒。方法:从引产胎儿牙胚组织中抽提总RNA,以Oligo(dt)为引物,逆转录合成牙胚cDNA利用PCR,从cDNA中扩增出人釉原蛋白成熟肽编码序列(约540bp),所得目的基因片断插入表达载体质粒PQE30,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,抽提重组质粒DNA,通过PCR、酶切和核苷酸序列分析,鉴定阳性克隆。结果:样品质粒测序证实,质粒PQE30中插入的基因片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全相同。结论:从人胚胎的牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列,成功构建含有人釉原蛋白成熟肽基因的重组表达质粒。