采用重叠PCR构建高灵敏度酵母细胞传感器评估遗传毒性化合物

采用重叠PCR（overlap PCR）方法构建了pdr5与snq2基因敲除组件,研究了pdr5、snq2基因突变对酵母细胞传感器评估遗传毒性的影响。考察了野生型、pdr5单基因突变、snq2单基因突变与pdr5、snq2双基因突变酵母细胞传感器暴露于系列浓度甲磺酸甲酯（MMS）、甲磺酸乙酯（EMS）、顺铂、4-硝基喹啉-N-氧化物（4NOQ）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、羟基脲、水杨酸和葡萄糖溶液24 h后的细胞生长抑制情况与16 h后的荧光诱导情况。研究结果表明,overlap PCR方法能够高效率构建基因突变酵母细胞传感器;snq2单基因突变与pdr5、snq2双基因突变细胞传感器检测遗传毒性的准确度为100%,高于野生型与pdr5单基因突变细胞传感器（87.5%）;pdr5、snq2双基因突变酵母细胞传感器表现出最高的遗传毒性检测灵敏度,为构建高准确度与灵敏度的酵母细胞传感器提供了思路与方法,为酵母细胞膜转运蛋白基因pdr5与snq2的进一步功能研究奠定了基础。     

一起由肠道侵袭性大肠埃希菌引起的食物中毒实验室分析

目的对食物中毒事件所采集的样品进行检测,查明本次中毒事件的致病因子,对后续治疗和预防控制工作提供实验室支持。方法运用实时荧光PCR和传统细菌分离鉴定两种方法对可疑食物中毒样品进行微生物检验。结果实时荧光PCR和血清凝集实验显示,此次事件的病原菌疑似志贺菌,生化鉴定为大肠埃希菌;菌株送上级疾控中心进行复检,经生化鉴定和致泻大肠埃希菌PCR确认试验,确定该事件病原菌为肠侵袭性大肠埃希菌。结论此次事件是一起由肠侵袭性大肠埃希菌引发的食物中毒事件,因志贺菌PCR试剂盒特异性不足、致泻大肠埃希菌和志贺菌存在血清交叉凝集等,导致本次检测没能及时得出正确结论。在食物中毒检验中,细菌学分离和鉴定是细菌检验定性的金标准,当其他检验方法结果与之矛盾时,应以生化反应结果为判定标准。     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。     

高通量测序技术检测非小细胞肺癌相关驱动基因的突变

目的：探讨高通量测序技术在非小细胞肺癌驱动基因检测中的应用。方法：应用 Ion Torrent 高通量测序平台,检测150例非小细胞肺癌（non?small?cell lung cancer,NSCLC）患者EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her?2和PIK3CA基因突变,并利用Sanger 测序法和微滴式数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）法检测150例NSCLC患者EGFR基因突变,对结果进行对比分析。结果：EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、Her?2和PIK3CA基因突变检出率分别为51.33%（77/150）、7.33%（11/150）、1.33%（2/150）、1.33%（2/150）、2.00%（3/150）和4.67%（7/150）。57例标本未检出任何基因突变,84例标本检出单个驱动基因发生突变。9例标本检出2个及以上驱动基因发生突变。Sanger测序法检测EGFR基因突变,突变检出率为38.67%（58/150）,与高通量测序法比较,差异有统计学意义（χ2=4.862,P=0.027）,高通量测序法的灵敏度为98.28%,特异度为78.26%。ddPCR法突变检出率为50.00%（75/150）,与高通量测序法比较,差异无统计学意义（χ2=0.053,P=0.818）,阳性一致率为82.67%,阴性一致率为80.00%,总一致率为81.33%。结论：高通量测序法更适合应用于NSCLC诊疗,Sanger测序法和ddPCR法可作为有益的补充。     

体外核酸扩增技术检测沙眼衣原体和淋球菌采用不同标本的比较分析

目的 探讨体外核酸扩增技术(NAATs)检测不同标本沙眼衣原体(CT)和淋球菌(NG)的价值.方法 选取2019年1月至2020年6月于本院就诊的3926例疑似STD女性患者为研究对象,无菌操作采集尿液和宫颈拭子标本,采用NAATs法测定CT、NG.比较尿液和宫颈拭子标本中CT感染率、CT感染率一致性,并分析CT感染年龄分布情况.结果 尿液和宫颈拭子标本中CT、NG感染率比较差异无统计学意义;Kappa检验显示,尿液和宫颈拭子标本中CT、NG感染的一致性良好(Kappa值=0.814、0.856,P=0.000、0.000);CT感染多发生于31～40岁人群,其次为41～50岁人群;NG感染多发生于>50岁人群,其次为41～50岁人群.结论 NAATs能检出不同标本中CT、NG感染情况,并及时发现合并感染,为临床诊治提供参考,进而改善患者预后.     

实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测解脲脲原体的临床价值分析

目的 探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测解脲脲原体(UU)的临床价值.方法 选取2018年5月至2020年5月于本院就诊的疑似泌尿生殖道感染患者80例,采集所有受检者的尿道/宫颈口拭子及尿样标本,分别采用液体培养法、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法、SAT法检测拭子标本中UU阳性表达情况,以液体培养法结果为金标准,评估SAT技术在UU检测中的临床价值.结果 液体培养法结果显示,80例患者中31例(38.75％)UU检测呈阳性,49例(61.25％)UU检测呈阴性;31例UU阳性患者中SAT(拭子)检出29例,检出率为93.55％,SAT(尿样)检出27例,检出率为87.10％,qRT-PCR检出28例,检出率为90.32％;3种检测方法检测UU阳性表达情况比较差异无统计学意义.SAT(拭子)、SAT(尿样)、qRT-PCR检测UU的灵敏度、特异度、误诊率、漏诊率、正确指数比较差异无统计学意义.结论 实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测解脲脲原体具有较高的灵敏度、特异度,且取材方便、检测快速、污染较低、结果准确,值得临床推广应用.     

一起由金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌引发食物中毒病原分析

目的 通过一起疑似葡萄球菌引发食物中毒进行葡萄球菌肠毒素检测,并结合检测出致病性葡萄球菌病原学分析,为下一步食物中毒处置提供诊断依据。方法 根据流行病学调查和国家标准《食品微生物学检验》GB4789,对可疑食物及患者呕吐物、肛拭子等进行了几种常见致病原菌分离培养,并直接采用实时荧光PCR方法对金黄色葡萄球菌肠毒素A~E基因进行分型,用全自动微生物鉴定分析仪进行系统生化鉴定,并做血浆凝固酶试验。结果 在食用剩余汉堡中分离出1株金黄色葡萄球菌、2名患者肛拭子中分离出2株金黄色葡萄球菌,1名患者呕吐物中分离1株血浆凝固酶阴性路邓葡萄球菌,利用PCR方法分别对其进行了肠毒素基因分型,结果显示,食用剩余汉堡中1株和2株患者肛拭子的金黄色葡萄球菌肠毒素均为SEA型,为同一型;1株患者呕吐物的路邓葡萄球菌的肠毒素为SEC型。 结论 该起食物中毒主要是由金黄色葡萄球菌产生SEA型肠毒素所导致,血浆凝固阴性路邓葡萄球菌跟金黄色葡萄球菌一样,也能产生肠毒素同样具有致病性作用,提示路邓葡萄球菌不单纯只是人类皮肤共生菌,或许还跟金黄色葡萄球菌同样具有侵袭性、产肠毒素等致病性,在进行公共卫生流行调查诊断时不能被忽视。     

重组酶聚合酶扩增技术在寄生虫快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）是一种新型核酸等温扩增技术,具有特异性强、灵敏度高、恒温反应、操作简单和耗时短等优点。该技术自2006年面世以来,被逐渐应用于医学、食品安全、公共卫生和农业生产等领域。寄生虫病不仅会影响人畜健康,还阻碍经济发展,带来严重的社会问题。对寄生虫病实现准确而快速的诊断有助于推进该类疾病的治疗进程,最大程度降低危害。本文综述了RPA技术的反应原理、反应条件以及在寄生虫快速检测方面的应用,分析RPA技术在原虫、吸虫和线虫检测中的敏感性和特异性。在原虫检测方面,RPA技术较为成熟,它的灵敏度明显优于传统的检测方法。在吸虫检测方面,RPA技术的敏感性和特异性等于或优于传统的检测技术。RPA技术在线虫检测方面的灵敏度优于聚合酶链式反应。此外,本文还对该技术在寄生虫病防疫工作的应用前景进行了展望。     

广东省揭阳市2016—2020年外环境禽流感病毒监测

目的 了解揭阳市外环境禽流感病毒动态分布情况和流行特点,评估人感染禽流感病毒的风险,为人禽流感防控提供科学依据。方法 按随机抽样的方法,对揭阳市2016—2020年5个县（市、区）禽类市场进行相关标本采集,用实时荧光定量（RT-PCR）对标本进行流感病毒A型检测,阳性标本再进行H5N6、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒核酸检测。结果 揭阳市2016—2020年共采集外环境标本1 798份,甲型流感病毒（FluA）阳性标本660份,阳性率为36.71%;其中H5N6、H7N9、H9N2亚型阳性率分别为1.61%、1.28%和21.91%。普宁市和惠来县的外环境禽流感病毒阳性率较高,分别为54.14%和51.43%。揭西县的外环境禽流感病毒阳性率最低,为4.84%。不同类型标本检测阳性率最高为清洗禽类污水（47.09%）。结论 揭阳市禽类市场外环境中存在H5N6、H7N9、H9N2及多种亚型混合的禽流感病毒污染,禽流感病毒流行区域较广,存在感染人的风险,应继续加强外环境禽流感实时监测和城乡禽类市场卫生监管。