生物信息学技术在疟原虫基因组研究中的应用

疟疾是一种流行广泛的热带寄生虫病 ,一直得到世界范围的广泛重视。恶性疟原虫 (Plasmodium falci-parum,P. f .)基因组研究从 1983年开始 ,1996年12月建立疟原虫数据库 ,主要内容包括以下方面 :核苷和蛋白信息、核苷和蛋白数据文件、疟原虫基因图谱数据和 Mal DB疟原虫基因组数据库[1] 。随着 PE公司快速测序仪的推出 ,疟原虫基因组数据将成倍增长。目前 ,P.f.2、 3和 9号染色体序列测定已经完成 ,预计在未来的 2～ 3年内 ,将有可能完成其基因组序列分析 ,疟原虫即将步入后基因组时代。大量的基因组数据必须借助生物信息学技术进行自动…     

日本血吸虫卵壳白基因的体外扩增

根据日本血吸虫卵壳蛋白基因的已知序列，借助计算机核酸序列软件分析，设计了一对引物。在5’端引物中引入HindⅢ酶切位点和起始密码子，在3’端引物中引入EcoRⅠ酶切位点和终止密码子，用PCR方法对日本血吸虫虫卵、雌虫、雄虫的基因组DNA进行体外扩增。1％琼脂糖凝胶电泳显示：雌虫和虫卵的基因组DNAPCR产物在618bp处出现特异扩增条带，而雄虫及对照组则无此条带出现。该条带与预期长度相符，并对PCR产物进行纯化和酶切。     

恶性疟原虫疫苗研究Ⅱ．一种新的化学拼接法重组多价保护性抗原的基因

将恶性疟原虫保护性抗原环子孢子蛋白（ＣＳＰ）、环状体感染红细胞表面抗原（ＲＥＳＡ）、裂殖子表面抗原１和２（ＭＳＡ１和ＭＳＡ２）４种抗原中具有Ｔ和／或Ｂ细胞表位的６个基因片段，按照我们设计的方案排成一条线性序列，经在计算机上分析比较后，分成长短不一的８个基因片段（Ｆ１～Ｆ８），其中Ｆ１、Ｆ３、Ｆ５和Ｆ７为正链片段，Ｆ２、Ｆ４、Ｆ６和Ｆ８为负链片段。每相邻两个片段间预设１５个互补碱基搭头。在ＤＮＡ合成仪上分别合成这８个片段后，把Ｆ２～Ｆ７６个片段分别磷酰化，按等摩尔浓度混合。经３０℃退火，使８个片段连接起来，然后按基因体外扩增的原理，填补互补碱基以外的缺口，重组成新的多价基因。我们把这种化学拼接法取名为“缺口填补法（Ｆｉｌｌｉｎｇ－ｑａｐＭｅｔｈｏｄ）”，经克隆和测序验证，表明这种方法具有效果好、经济、简便等优点。     

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的　测定我国恶性疟原虫海南株 (FCC1/ HN)谷氨酸富集蛋白 (GARP)、丝氨酸重复抗原 (SERA)和裂殖子表面蛋白 1(MSA1)基因序列 ,并进行序列分析。　方法　采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中扩增 GARP、SERA和 MSA1基因片段 ,分别插入到测序载体上进行测序。应用 DNAstar软件辅助分析 3种抗原基因的结构及 3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。　结果　恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP基因全长 2 2 6 3bp,编码6 82个氨基酸残基 ,谷氨酸占 2 3.6 1% ,包含 5个典型的氨基酸重复序列 ;SERA基因全长 344 8bp,编码 995个氨基酸残基 ,丝氨酸含量为 10 .6 5 % ,包含 1个连续 32个丝氨酸 (S)残基的序列 ;MSA1基因全长 5 0 85 bp,编码 16 94个氨基酸残基 ,MSA1的氨基酸序列符合 MAD2 0型特征。恶性疟原虫 FCC1/ HN株与 3D7、FC2 7株 GARP的序列差异主要集中于 C-末端 ;FCC1/ HN株与 FCR3、3D7、FCBR、Hondulas- 1株 SERA的序列差异主要集中于 N-端。FCC1/ HN株与MAD2 0、3D7、HN1、HN2、FC2 7、RO- 71、RO- 33、CAMP和 Palo- alto株 MSA1的同源性高 ,K1和 WEL L COME株 MSA1的同源性高 ,各分离株 MSA1的序列差异主要处于第 2至 16分区。　结论　了解了恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP、SERA和 MSA1的     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

华支睾吸虫膜抗原/排泄分泌抗原酸性磷酸酶的克隆、表达、生物学特征分析及组织定位

 目的:对华支睾吸虫(Clonorchis sinensis, Cs)成虫酸性磷酸酶 (acid phosphatase, AP)进行克隆、表达、生物学特征分析、组织定位及膜抗原/排泄分泌抗原鉴定。方法:对CsAP进行生物信息学、分子生物学、免疫组化及明胶酶谱分析。结果:从Cs cDNA文库中筛选出编码AP新基因,全长1 410 bp,重组并由大肠杆菌表达、纯化,得到分子量为55 kD的重组蛋白CsAP。Western blotting分析表明,CsAP既是膜抗原又是分泌排泄抗原;免疫组化显示,CsAP荧光显示于成虫的表皮层和肠支,在囊蚴也有显示,在雷蚴和尾蚴未显示荧光;ELISA分析表明CsAP识别华支睾吸虫病人和日本血吸虫病人存在吸虫间的交叉免疫反应,CsAP及粗抗原识别轻、中、重度感染程度华支睾吸虫病人的差别不明显。重组蛋白免疫大鼠后,总IgG抗体滴度于3周达较高峰,抗体效价大于1∶25 600。明胶降解实验表明：CsAP具降解胶原能力。结论: 上述结果表明,CsAP在大肠杆菌中高效表达,具有较好的免疫原性,但血清诊断价值不理想;CsAP可能既是膜抗原,又是排泄分泌抗原。     

亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位

目的 表达亚洲带绦虫（Taenia asiatica,Ta）成虫烯醇化酶（enolase,ENO）基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。 方法 通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a（+）,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。 结果 PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a（+）-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量（Mr）为47 000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37 mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。 结论 纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。     

日本血吸虫(中国大陆株)表达基因的分离和EST序列测定

目的 运用表达标签技术（ＥＳＴ方法）,从ＳｊｃＤＮＡ文库中分离、鉴定血吸虫表达基因序列。方法 应用ＥＳＴ方法,人ＳｊｃＤＮＡ文库中随机挑出单个重组克陲 ＰＣＲ直接序列分析,通过互联网将获得的ＥＳＴ序列送入ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ进行同源性检素,并将发现的未知基因ＥＳＴ序列送入ＮＣＢＩｄｂＥＳＴ以获得ＧｅｎＢａｎｋ进入号。结果 分离了１００个ＳｊＧｅｎＢａｎｋ中已知的血吸虫基因序列,１９个为未知基因序     

进入疟疾研究的后基因组时代

恶性疟原虫基因组测序有望带来疟疾研究方法的革命。除了简单的基因发现,基因组测序将便于综合鉴定寄生虫发育阶段的基因表达、病理以及对药物治疗的宿主遗传背景等环境变量的反应。本文介绍了恶性疟原虫基因组测序计划的近况及功能基因组学开发的生物信息学及其分析工具的应用,其目的是根据对疟原虫生物学的深入观察,确定合理的、基于信息的、新的治疗策略和目标。