3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的　测定我国恶性疟原虫海南株 (FCC1/ HN)谷氨酸富集蛋白 (GARP)、丝氨酸重复抗原 (SERA)和裂殖子表面蛋白 1(MSA1)基因序列 ,并进行序列分析。　方法　采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中扩增 GARP、SERA和 MSA1基因片段 ,分别插入到测序载体上进行测序。应用 DNAstar软件辅助分析 3种抗原基因的结构及 3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。　结果　恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP基因全长 2 2 6 3bp,编码6 82个氨基酸残基 ,谷氨酸占 2 3.6 1% ,包含 5个典型的氨基酸重复序列 ;SERA基因全长 344 8bp,编码 995个氨基酸残基 ,丝氨酸含量为 10 .6 5 % ,包含 1个连续 32个丝氨酸 (S)残基的序列 ;MSA1基因全长 5 0 85 bp,编码 16 94个氨基酸残基 ,MSA1的氨基酸序列符合 MAD2 0型特征。恶性疟原虫 FCC1/ HN株与 3D7、FC2 7株 GARP的序列差异主要集中于 C-末端 ;FCC1/ HN株与 FCR3、3D7、FCBR、Hondulas- 1株 SERA的序列差异主要集中于 N-端。FCC1/ HN株与MAD2 0、3D7、HN1、HN2、FC2 7、RO- 71、RO- 33、CAMP和 Palo- alto株 MSA1的同源性高 ,K1和 WEL L COME株 MSA1的同源性高 ,各分离株 MSA1的序列差异主要处于第 2至 16分区。　结论　了解了恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP、SERA和 MSA1的     

恶性疟原虫Pf332基因片段的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒的构建

目的 构建包含恶性疟原虫Pf332基因片段的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒。方法 从FCCl／HN株基因组DNA中PCR扩增P1332基因片段，P332-RO、P332-R1和P332-R2；用PCR扩增法合成鼠IgG轻链信号肽的编码序列。用定向克隆法分别构建分泌型重组质粒pcDNA3-s—P332-R0、pcDNAl-s—P332-R1、pcDNA3-s—P332-R2和非分泌型重组质粒pcDNA3-s—P332-R0、pcDNA3—s—P332-R1、pcDNA3—s—P332-R2。阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 PCR扩增得到特异的FCCl／HN株P1332基因片段，P332-R0、P332-R1、P332-R1，大小分别为489、429和393bp。用PCR扩增法合成63bp的Balb／c小鼠IgG轻链信号肽的编码序列。酶切、PCR及测序鉴定表明获得了正确的含P1332基因片段的分泌型、非分泌型重组质粒。结论 成功构建分别包含恶性疟原虫P1332基因片段-1332-R0、P332-R1和P332-R2的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的筛选及EST序列测定

目的 通过对日本血吸虫(Sj)成虫cDNA库的核酸杂交筛选，分离出Sj卵壳蛋白相关基因的cDNA克隆，并进一步探讨该基因的结构与功能关系。方法 用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对Sj成虫cDNA库进行膜原位杂交筛进，挑选出阳性克隆，用通用引物进行PCR扩增，获得cDNA插入片段，采用PCR直接序列测定法，对其部分序列进行测定，而后将EST序列输入GENEBANK进行同源性检索和分析。结果 本实验从Sj cDNA库筛选到9个不同的阳性克隆，用通用引物扩增出9十分子量大小不同的单一条带，其中两个为已知序列，其余7个为新的EST序列。结论 用寡核苷酸标记探针对Sj库中进行校酸杂交筛选是寻找特定目的基因的有效方法。     

RNA干扰技术在人体寄生虫研究中的应用进展

RNAi是Fire等于1998年在研究秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans）基因组计划时，首次在线虫中阐述双链RNA（duuble stranded RNA，dsRNA）能特异性和选择性地明显抑制目的基因的表达而命名的新技术，随后此技术在全球得以广泛的开展和应用，并在其它动物如果蝇、锥虫、涡虫等中相继证实，已经成为研究基因功能、新基因筛选、基因治疗和寻找药物靶点的重要工具，成为分子生物学研究中最为活跃的热点之一。现将该技术在人体寄生虫学研究中的应用进展综述如下。     

恶性疟原虫海南株MESA基因的序列分析

成熟疟原虫感染红细胞表面抗原 (ｍａｔｕｒｅｐａｒａｓｉｔｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ ,ＭＥＳＡ)又称恶性疟原虫红细胞膜蛋白 2 (Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ 2 ,ＰｆＥＭＰ2 )或ＰＰ30 0 ,是成熟期疟原虫合成的磷蛋白。它通过小泡运送至感染的红细胞膜骨架上[1 ,2 ] ,与红细胞蛋白 4 .1以非共价方式紧密结合。ＭＥＳＡ包含 7个明显的重复区 ,重复区占全部氨基酸残基的 60 % [3] 。至今 ,ＭＥＳＡ在感染的红细胞中的功…     

一种华支睾吸虫亲肌素样基因的克隆、表达与免疫学功能初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫亲肌素样蛋白(CsMLP)进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法应用生物信息学分析软件,分析CsMLP的序列特点和基本理化特征;将CsMLP基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsMLP蛋白免疫SD大鼠获得抗血清;用Westernblot进行免疫反应性及免疫原性分析;应用免疫荧光方法观察CsMLP在华支睾吸虫成虫的定位。结果该cDNA序列全长为900bp,编码190个氨基酸,具有Calponin功能域;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-CsMLP重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中获得高效表达,分子量为21300Mr;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清、感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清识别;CsMLP主要定位于虫体富含肌肉组织的口、腹吸盘、咽部,在表膜、肠壁也有分布。结论 CsMLP可在原核表达系统中呈现高效的可溶性表达,具有免疫原性,其主要分布在华支睾吸虫肌肉丰富的组织。     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.     

日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达序列标签的获取及分析

随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库单个重组克隆进行部分测序以获得EST（ex-pressed sequence tag),获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GeneBank数据库进行比较及同源性分析。结果在随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库150个单个重组克隆中,获得了56个有价值的EST序列,其中47个在GeneBank dbEST中登录,7.1%EST序列为日本血吸虫已知序列,3.6%为日本血吸虫同源序列,曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占25%,未知序列占55.6%。通过同源性分析可知,大多数和同源序列具有看家基因功能。另外,也发现了几个有价值的基因。     

恶性疟原虫FCC1/HN株exp-1基因的克隆及序列分析

分泌蛋白 1(ｅｘｐｏｒｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ 1,ｅｘｐ 1)又称环子孢子相关抗原[1] ,ＱＦ116抗原[2 ] 或抗原 5 .1[3 ] ,是 2 3ｋＤａ的恶性疟原虫红内期抗原 ,在肝期的晚期也有表达[4] 。ｅｘｐ 1由疟原虫表面分泌 ,定位到纳虫空泡和感染的红细胞内的膜结构上[5] 。本文克隆、测定、分析了恶性疟原虫海南株 (ＦＣＣ1/ＨＮ)ｅｘｐ 1基因序列 ,并对ＦＣＣ1/ＨＮ与国外的 3Ｄ7[5] 、Ｋ1[6] 、ＦＣ2 7[1] 、ＦＣＲ3(ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ .ＡＦ0 6 10 80 )株ｅｘｐ 1基因编码的氨基酸残基序列进行同源性比较。1　材料与方法根…     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的原核表达

目的 进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因,将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1,转化感受态BL21/DE3菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆,IPTG诱导pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌,用SDS-PAGE和Wester-blot分析表达产物。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导可表达与GST融合的蛋白（约40kDa）,抗GST抗体能特异性识别该蛋白。结论 成功原核表达了Sj16蛋白,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下了基础。