华支睾吸虫溶血磷脂酶对肝星状细胞体外作用的研究

目的探讨华支睾吸虫溶血磷脂酶(Cs LysoPLA)对肝星状细胞的作用。方法实验分为4组:PBS对照组为PBS孵育肝星状细胞系LX-2细胞24 h;Cs LysoPLA单独刺激组为Cs LysoPLA(10μg/mL)单独孵育LX-2细胞24 h;联合刺激组为不同浓度Cs LysoPLA(1、5、10μg/mL)孵育LX-2细胞2 h后,IL-13(20 ng/mL)孵育24 h;IL-13单独刺激组为IL-13(20 ng/mL)单独孵育LX-2细胞24 h;逆转录荧光定量PCR(qRT-PCR)检测星状细胞活化指标分子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及纤维化相关分子胶原蛋白Ⅰ型(Collagen-Ⅰ)、胶原蛋白Ⅲ型(Collagen-Ⅲ)以及促纤维化分子转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)的mRNA水平。Western Blotting检测不同浓度Cs LysoPLA(1、5、10μg/mL)联合IL-13(20 ng/mL)刺激时LX-2细胞α-SMA蛋白表达量。结果 Cs LysoPLA(10μg/mL)可直接抑制LX-2细胞α-SMA、Collagen-Ⅲ的转录,与PBS对照组相比差异有统计学意义(P=0.014 2、0.002 7);并且Cs LysoPLA(10μg/mL)可刺激LX-2细胞TGF-β1、PDGF基因转录升高,与PBS对照组相比差异有统计学意义(P=0.009 1、0.003 4);Cs LysoPLA(10μg/mL)可以下调IL-13引起的α-SMA、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、TGF-β1的mRNA水平的升高,与单独IL-13刺激组相比差异有统计学意义(P=0.003 0、0.011 9、0.043 0、0.025 6);Western Bloting结果显示,不同浓度Cs LysoPLA(1、5、10μg/mL)均可以下调IL-13引起的星状细胞活化分子α-SMA的表达,与单独IL-13刺激组相比差异有统计学意义(P=0.008 0、0.000 5、0.000 2)。结论 Cs LysoPLA(10μg/mL)在高浓度下既可以直接抑制LX-2细胞纤维化,又可以抑制IL-13引起的LX-2细胞纤维化,可能在华支睾吸虫严重感染所致纤维化过程中发挥了抑制纤维化的作用。     

肺炎链球菌不同菌株自溶酶基因的克隆、序列分析及重组表达

目的克隆肺炎链球菌自溶酶(LytA)的基因序列，并进行重组表达。方法分别提取不同临床分离株的基因组DNA，根据已知肺炎链球菌野生R6株LytA基因序列设计引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因片段克隆人原核表达质粒，然后测序；利用生物信息学方法，对不同临床分离株LytA基因序列进行比较分析，同时进行LytA基因的重组表达。结果从不同临床分离株的基因组中均扩增出完整的LytA基因片段，成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-LytA。比较不同临床分离株LytA基因的DNA序列及推测的氨基酸序列，发现各株LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异。通过异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导，LytA基因在大肠埃希菌JM109中得到高效表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示pGEX-4T-1-LytA融合蛋白相对分子质量约62000，与理论预测一致。结论序列分析发现各分离株的LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异，但同源性极高，推测LytA基因序列保守，可用于疫苗研发。     

华支睾吸虫Severin与HBV-X共同作用对肝细胞和肝癌细胞凋亡和周期影响的相关性研究

目的研究华支睾吸虫Severin蛋白(Csseverin)与HBV-X蛋白(HBX蛋白)共同作用对肝细胞和肝癌细胞凋亡和周期的影响。方法构建表达HBX的稳转肝细胞和肝癌细胞株,经诱导凋亡后用纯化Severin蛋白孵育,检测Severin蛋白对细胞凋亡和周期影响,染色后用流式细胞术检测细胞各期凋亡比例和处于不同周期细胞比例。结果随Csseverin浓度升高,稳转HBX的肝细胞株凋亡比例显著降低,由(24.13±0.68)%降低到(10.72±0.29)%;细胞增殖期比例增加,由15.43%增加到27.72%,而空载质粒对照组无明显变化。随Csseverin浓度升高,稳转HBX的肝癌细胞株凋亡比例显著降低,由(27.75±1.21)%降低到(3.91±0.75)%;细胞增殖期比例增加,由31.96%增加到38.04%。结论 Csseverin蛋白与HBV-X共同作用有抑制肝癌细胞凋亡,促进细胞增殖的作用。     

恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的　构建恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)CSP3′末端基因的原核表达载体 ,并对CSP3′末端基因进行序列测定。方法　根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物 ,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因 ,将其克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,转化大肠杆菌JM10 9;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因 ,其片段大小为 2 2 5bp ,构建的阳性重组质粒pGEX 4T 1 CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致 ,测序结果进一步确认了插入片段的正确性。　结论　成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒 ,为进一步研究其功能奠定了基础。     

恶性疟原虫重组质粒DNA接种诱导BALB/c小鼠的免疫应答

目的：观察重组质粒ＤＮＡ直接免疫接种诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的免疫应答水平，为恶性疟原虫ＤＮＡ疫苗在动物和人体的应用提供依据。方法：构建编码多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＰＣＲ法检测免疫鼠的肌肉、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和肺组织中ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ、Ｔ淋巴细胞转化试验、体外抑制试验观察其诱导的体液免疫及细胞免疫水平。结果：用ＰＣＲ法从上述组织中均检测到ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８，ＥＬＩＳＡ法测得免疫鼠血清的特异性抗体滴度达１２５６０，淋巴细胞转化试验显示恶性疟原虫可溶性抗原能特异性地剌激免疫鼠脾细胞增殖，免疫血清在体外还能抑制恶性疟红内期疟原虫的生长、发育。结论：编码恶性疟原虫多价保护性抗原的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ８直接免疫接种，能特异性地剌激ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答，其免疫血清在体外对疟原虫生长发育具有明显抑制作用。     

恶性疟原虫疫苗研究：IX.主要裂殖子表面蛋白1C端类表皮…

恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白１（ＭＳＰ１）在其分子Ｃ－端ＭＰＳ－１１９具有两个类ＥＧＦ结构，其中类ＥＧＦ－１为特异性抗体抑制原虫侵入细胞的靶位之一。本文通过酚－氯仿抽提，乙醇沉淀法提取恶性疟原虫（ＦＣＣ－１ＨＮ株）基因组ＤＮＡ，再用ＰＣＲ扩增类ＥＧＦ－１基因，经酶切纯化后插入质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，经ＰＣＲ筛选及双酶切鉴定，筛选出含类ＥＧＦ－１基因的阳性克隆子。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒S蛋白部分序列1的纯化及免疫活性分析

目的表达和纯化严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒S蛋白部分序列1（S1）,分析其诱导的免疫应答.方法大量诱导表达SARS冠状病毒S1蛋白,经超声裂解细菌后,取上清液进行亲和层析以纯化S1蛋白,并冻干浓缩;用纯化的S1蛋白免疫小鼠3次,间接酶联免疫吸附法（ELISA）检测产生的抗体IgG及其亚类的滴度,分析S1蛋白诱导的免疫应答.结果表达的S1蛋白主要存在于包涵体中,裂解上清液中存在少量S1蛋白;亲和层析纯化获得了能被SARS患者混合血清识别的S1蛋白,融合蛋白免疫小鼠3次后诱导产生了高滴度的IgG抗体和Th1/Th2型的免疫应答.结论纯化的S1蛋白具有良好的免疫学活性.     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的 从日本血吸虫(S．japonicum)尾蚴文库扩增S．japonicum再感染相关蛋白(RIRP)基因．进行克隆并原核表达出RIRP，为进一步的功能研究奠定基础。方法 根据已登陆的S．japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物，以S．japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA，将该基因的cDNA克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和真核载体pcDNA3．1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的pGEX-4T-1／RIRP在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗-26 ku GST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 从S．japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为462 bp的cDNA片段，经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含153个氨基酸的蛋白质-RIRP，预测其分子质量单位为17．545ku。RIRP cDNA已被成功克隆人pGEX-4T-1和pcDNA3．1载体，大肠埃希菌BL21(DE3)编码一个约17ku的蛋白质。结论 RIRP基因首次从S．japonicum尾蚴文库中扩增出来，并成功构建了原核和真核表达载体，而且，它首次由大肠埃希菌表达，表达蛋白的分子质量单位约17ku。     

序列标签法寻找日本血吸虫新基因

目的　寻找日本血吸虫新的疫苗候选分子 ,通过构建基因的反义核酸表达载体进行基因性质功能研究。　方法　运用表达序列标签法寻找并获得日本血吸虫新基因 ,对未知基因进行功能分析 ,并构建反义真核表达载体。　结果　获得表达序列标签 JAYL0 2 30的全长 c DNA序列 ,其推导氨基酸序列与人类和猪等生物的抗凋亡因子 1具有同源性 ,将之反向克隆入真核表达载体 p EGFP- N3中。　结论　表达序列标签法与生物信息技术结合有利于寻找新基因 ,反义核酸载体的构建为进一步研究基因功能提供帮助     

广州管圆线虫致病机制的研究进展

广州管圆线虫是一种人兽共患寄生虫，幼虫侵入人体后可移至大脑，主要引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。其发病为幼虫移行，幼虫在颅部占位并释放代谢产物，基质金属蛋白酶与纤溶酶原活化因子的产生，嗜酸性粒细胞对神经细胞的毒害及超敏反应等多因素作用的结果。偶尔该虫也可侵犯眼球，眼球病变主要是免疫反应导致的损害。了解广州管圆线虫的发病机制，对该病的防治和诊断具有重要意义。