恶性疟虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

目的：克隆并测定恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）肝期抗原1基因（LSA－1）3′端序列,比较FCC1／HN株与国外分离株LSA－1,3′端序列的差异。方法：应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增LSA－1,3′端序列,用T－A克隆法将其克隆入pMD18－5载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA－1,3′端序列的同源性分析。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN LSA－1,3′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT－LSA－1重组质粒。测序表明,所克隆的LSA－1,3′端大小为795bp,编码264个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株国外的NF54、T9／96、KEN、PNG及BRA株LSA－1,3′端编码的氨基酸序列只在3个位点存在不同。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN LSA－1,3′端片段。序列测定及同源性分析表明,FCC1／HNLSA－1,3′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

恶性疟原虫红内期p41—3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异。方法 根据p41-3基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcDNA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定。测序表明,FCC1／HN株p41-3基因大小为2137bpo,编码375个氨基酸,恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98．98％,编码氨基酸序列同源性为99．73％。结论 从恶性疟原虫FCCl/HN株 基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1／HN株p41-3基因的序列;FCC1／HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性。     

恶性疟Dipstick-免疫胶体金检测试纸条和ICT测试卡现场实验

目的 现场评价自制的恶性疟Dipstick-免疫胶体金检测试纸条和商品疟疾ICT测试卡的敏感性和特异性及稳定性。方法 以常规镜检法作为标准,用Dipstick条和ICT卡对镜检确认的疟疾和非疟发热病人血样平行检验。结果 Dipstick条恶性疟阳性的符合率为95％,特异性为100％,30％以上活性保持时间为45天左右;ICT卡的恶性疟(含混合感染)阳性符合率为100％,单纯间日疟符合率为97％,特异性为100％,不能区分混分感染,稳定性超过Dipstick条。结论 Dipstick条仍需改进完善。ICT卡敏感特异、简便快速,是替代传统镜检较好的一种方法。     

免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定

目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫ｃＤＮＡ文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫ｃＤＮＡ文库基因的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转染大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经抗生素及呈色底物Ｘ－ｇａｌ粗筛,再用限制性内切酶及ＰＣＲ方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中４个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中,获得４个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。     

恶性疟原虫热休克蛋白86(HSP86)基因置换型和插入型打靶载体的构建

目的 对恶性疟原虫热休克蛋白基因进行体外扩增,构建ＨＳＰ８６基因打靶载体,利用基因敲除技术进行恶性疟原虫热休克蛋白基因功能的研究。方法 恶性疟原虫体外培养,基因组ＤＮＡ提取,目的基因扩增,载体与目的片段连接、阳性克隆筛选及酶切鉴定。结果 经酶切鉴定ＰＣＲ产物及插入片段大小与预期值相符,进一步测序鉴定证实ＰＣＲ产物及插入片段为所需目的基因片段。插入片段经酶切鉴定证实插入方向正确。结论 成功构建了用于     

恶性疟原虫海南分离株(FCC1／HN)裂殖子表面蛋白2(MSA2)真核表达载体的构建

目的 构建恶性疟原虫海南分离株（ＦＣＣ１／ＨＮ）裂殖子表面蛋白ＭＳＡ２的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＭＳＡ２,为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。方法 采用ＰＣＲ技术对ＦＣＣ１／ＨＮ基因组ＤＮＡ ＭＳＡ２基因进行扩增,扩增产物经纯化后用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切,然后定向克隆入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３,连接产物转化大肠杆菌ＴＧ１,再用相同的内切酶酶切和ＰＣＲ扩增对重组子进行鉴定。结果 筛选出的     

恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ全编码区基因的真核克隆及表达

目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＨＲＰⅡ全编码区基因,经ＨｉｎｄⅢ和Ｂａｍ ＨＩ双酶切后定向克隆入带ＣＭＶ启动子的真核高效表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＨＲＰⅡ／ｐｃＤＮＡ３重组载体;用脂质体法将重组载体转染ＨｅｐＧ２肝癌细胞,经Ｇ４１８加压筛选后,收集阳性克隆细胞培养上清,表达产物进     

恶性疟原虫多价保护性抗原免疫血清对恶性疟原虫在体外生长发育的影响

本文观察人工化学合成与重组的复合基因 Pf CMR未纯化抗原与纯化抗原免疫 BABL/ c小鼠的免疫血清 ,对恶性疟原虫在体外生长发育的影响。实验结果显示 ,抗未纯化抗原和抗纯化抗原两种免疫血清对疟原虫体外生长均有明显的抑制作用 ,抑制效果与加入抗血清的浓度及抗体作用的时间有关。随着抗体作用时间的延长 ,抑制效果更明显。当血清稀释度为 1∶ 40 ,1∶ 80 ,1∶ 16 0时 ,未纯化抗原与纯化抗原免疫血清对疟原虫第 2增殖周期 ( 72h)的抑制率分别达 6 7.91%、43.2 8%、2 4.6 3%和 5 8.2 1%、5 2 .2 4%、38.0 6 %。免疫血清作用后疟原虫呈发育不良和虫体皱缩等现象 ,提示可能与复合抗原中的多个保护性抗原位点表达诱导产生了多种功能抗体有关     

日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的EST序列测定及同源性分析

目的 运用表达序剜标签技术(EST方法),从Sj cDNA库中分离、鉴定和鉴定血吸虫表达基因序列。方法 应用EST方法,从Sj cDNA库中随机挑选出单个重组克隆进行PCR直接序列分析,通过互联网将获得的EST序列送入NCBl GenBank进行同源性检索,并对检索结果进行分析。结果 分离了46个Sj cDNA克隆,并对18个克隆cDNA插入片段的PCR进行直接序列分析,获得了16个EST序列。其中13个EST序列为GenBank中已知的血吸虫基因序列．3个未发现明显同源(score<200)基因序列。结论 采用EST-PCR直接序列分析方法可大量获得血吸虫表达基因EST序列,为进一步开展日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的研究奠定了基础。