一种华支睾吸虫亲肌素样基因的克隆、表达与免疫学功能初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫亲肌素样蛋白（CsMLP）进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法应用生物信息学分析软件,分析CsMLP的序列特点和基本理化特征;将CsMLP基因克隆到原核表达质粒pET．28a（＋）中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsMLP蛋白免疫SD大鼠获得抗血清;用Westernblot进行免疫反应性及免疫原性分析;应用免疫荧光方法观察CsMLP在华支睾吸虫成虫的定位。结果该cDNA序列全长为900bp,编码190个氨基酸,具有Calponin功能域;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET．28a（＋）-CsMLP重组质粒构建成功;SDS—PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21／DE3中获得高效表达,分子量为21300Mr;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清、感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清识别;CsMLP主要定位于虫体富含肌肉组织的口、腹吸盘、咽部,在表膜、肠壁也有分布。结论CsMLP可在原核表达系统中呈现高效的可溶性表达,具有免疫原性．其主要分布在华支睾吸虫肌肉丰富的组织。     

华支睾吸虫ATP合酶B亚基全长基因的生物信息学分析

目的从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别ATP合酶B亚基,利用生物信息学方法预测其结构和功能特征,用以指导实验研究。方法利用生物信息学网站的各种在线分析工具和Vector NT Isuite软件包,识别华支睾吸虫ATP合酶B亚基基因并预测编码蛋白质的各种结构与功能特征,并根据该基因构建种系分子进化树。结果Blastx分析该基因为全长基因,属于ATP合酶B亚基家族,其分子进化树与种系进化过程非常吻合。该基因全长1008bp,编码300个氨基酸,含有线粒体转运肽、两个跨膜区、一个核定位序列和多个磷酸化位点,具有较稳定的理化性质。结论ATP合酶B亚基是一个理想的真核种系进化的分子标志。华支睾吸虫ATP合酶B亚基具有线粒体和细胞核的双重定位序列,提示该蛋白可能在华支睾吸虫的能量代谢途径中发挥独特的调节作用。     

十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物Ad-TIMPL-1基因克隆及其原核表达

目的克隆十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物（TIMPL）Ad-TIMPL-1基因并进行原核表达。方法分别用3’RACE及RT-PCR技术从十二指肠钩虫成虫cDNA中扩增编码Ad-TIMPL-1的cDNA3’末端及5’末端序列;序列经拼接后进行初步生物信息学分析;将Ad-TIMPL-1成熟肽编码序列克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒;重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆获得了编码Ad-TIMPL-1的全长cDNA序列并登记到GenBank（accession no.EF495071）;Ad-TIMPL-1完整阅读框为396bp,编码132个氨基酸残基组成的蛋白,含16个氨基酸残基组成的信号肽;成功构建了原核表达重组质粒pET-32a/Ad-TIMPL-1,并在大肠杆菌中得到了表达。结论本研究首先从十二指肠钩虫中克隆到了Ad-TIMPL-1基因并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

华支睾吸虫卵黄前体蛋白B基因的识别、序列分析和克隆表达

为识别和克隆华支睾吸虫新基因 ,对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序 ,并利用在线生物信息学工具进行序列分析 ,识别华支睾吸虫未知基因 ,同时根据PGEX -4T- 1多克隆位点及未知基因的序列设计引物 ,PCR扩增目的基因 ,并构建原核重组质粒。结果发现了CsvpB基因 ,其完整阅读框含 76 2个碱基 ,编码 2 5 4个氨基酸 ,理论分子量为 2 7. 7kDa。序列分析表明 ,CsvpB蛋白与其它物种的卵黄前体蛋白有较高的同源性 ,所构建的重组原核表达质粒PGEX- 4T- 1 vpB经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。     

华支睾吸虫膜抗原/排泄分泌抗原酸性磷酸酶的克隆、表达、生物学特征分析及组织定位

 目的:对华支睾吸虫(Clonorchis sinensis, Cs)成虫酸性磷酸酶 (acid phosphatase, AP)进行克隆、表达、生物学特征分析、组织定位及膜抗原/排泄分泌抗原鉴定。方法:对CsAP进行生物信息学、分子生物学、免疫组化及明胶酶谱分析。结果:从Cs cDNA文库中筛选出编码AP新基因,全长1 410 bp,重组并由大肠杆菌表达、纯化,得到分子量为55 kD的重组蛋白CsAP。Western blotting分析表明,CsAP既是膜抗原又是分泌排泄抗原;免疫组化显示,CsAP荧光显示于成虫的表皮层和肠支,在囊蚴也有显示,在雷蚴和尾蚴未显示荧光;ELISA分析表明CsAP识别华支睾吸虫病人和日本血吸虫病人存在吸虫间的交叉免疫反应,CsAP及粗抗原识别轻、中、重度感染程度华支睾吸虫病人的差别不明显。重组蛋白免疫大鼠后,总IgG抗体滴度于3周达较高峰,抗体效价大于1∶25 600。明胶降解实验表明：CsAP具降解胶原能力。结论: 上述结果表明,CsAP在大肠杆菌中高效表达,具有较好的免疫原性,但血清诊断价值不理想;CsAP可能既是膜抗原,又是排泄分泌抗原。     

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出760bp的片段,反向插入到pGEM-3Zf( )载体上,获得pGEMBF18克隆,限制性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长编码片段,与原核表达载体pGEX-5T连接,构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的7.53%,Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。     

MAGE-D4a融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤相关抗原MAGE-D4a的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:PCR法从胶质瘤组织cDNA中扩增MAGE-D4a基因全长编码区,连接入原核表达载体pMAL-c2,筛选、鉴定阳性克隆并测序。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达,表达产物经AmyloseResin亲和层析分离纯化,并且对纯化的融合蛋白进行质谱鉴定。结果:成功扩增了MAGE-D4a基因;重组质粒在Rosetta大肠杆菌中诱导表达出MBP/MAGE-D4a融合蛋白;优化了MAGE-D4a原核表达体系的最适条件;蛋白质谱分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符。结论:获得了高效表达、可溶性的MAGE-D4a重组蛋白,为抗体的制备及血清学分析奠定了基础。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE-3基因3’端657bp片段，对其编码的蛋白羧基端97-314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE-3基因全长cDNA的pUC19／MAGE-3质粒中经聚合酶链式反应(PCR)扩增3’端657bp片段，并克隆入pGEX-4T-1载体，构建重组原核表达质粒pGEX／MAGE-3，对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19／MAGE-3重组质粒中扩增获得一条约660bp的条带，测序结果表明与GenBank公布的MAGE-3序列一致，成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基-β-半乳糖苷(Isopropyl—beta—D—thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后表达Mr为54000的谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferse，GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％。结论 成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，获得了MAGE-3蛋白羧基端97～314aa融合蛋白，为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶AduGST-1基因的克隆和重组表达

目的克隆十二指肠钩虫谷胱甘肽转移酶（GST）AduGST-1基因,并在大肠埃希菌中表达获得重组AduGST-1。方法设计特异引物,以十二肠钩虫成虫cDNA为模板,通过PCR扩增AduGST-1基因。将获得的AduGST-1编码序列克隆至原核表达载体pETHF,构建重组表达质粒pETHF/AduGST-1。重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达、Ni亲和层析分离纯化重组AduGST-1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达及纯化情况。结果成功扩增到AduGST-1全长编码序列,并登记到GenBank（accession no.JQ812812）。AduGST-1编码序列长度为624bp,编码307个氨基酸残基。成功构建了重组表达质粒pETHF/AduGST-1,在BL21（DE3）中表达并纯化了重组AduGST-1。结论首次报道从十二指肠钩虫中分离到GST基因,该基因可在大肠埃希菌中高效表达,并分离纯化了重组GST蛋白,为进一步研究AduGST-1功能与应用奠定了基础。     

华支睾吸虫成虫RPEF基因产物及其抗RPEF多克隆抗体的制备

目的 体外制备华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因产物及抗RPEF多克隆抗体.方法 亲和纯化试剂盒纯化表达蛋白pGEX-4T-1-RPEF,凝血酶酶切表达蛋白制备重组蛋白RPEF,将重组蛋白RPEF免疫小鼠,制备多克隆抗血清,检测抗体滴度和抗血清特异性.结果 体外制备的RPEF蛋白经SDS电泳呈单一条带;酶联免疫吸附结果显示,免疫过程抗体滴度呈连续上升趋势;免疫印迹结果显示,小鼠抗血清具有抗RPEF特异性.结论 获得较专一的华支睾吸虫RPEF蛋白和RPEF抗血清.     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT—PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX—1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS-PAGE和Western blowing对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21％;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的扩增编码Ⅳ型菌毛蛋白的嗜肺军团菌pilE基因,构建重组质粒pET32a（＋）-pilE并在原核系统中表达．纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE．为进一步探讨Ⅳ型菌毛蛋白的作用及其作为军团病的诊断抗原提供实验基础。方法采用聚合酶链式反应（PCR）从嗜肺军团菌扩增得到pilE基因,构建重组质粒pET32a（＋）-pilE,转化大肠杆菌BL21（DE3）并用聚合酶链式反应、限制性酶切分析、序列分析鉴定后,IPTG诱导表达PIIJE蛋白,用硫酸十二烷酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）、Western印迹鉴定。使用HisTrap^TM HP亲和层析柱纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。结果扩增出430bp的pilE基因;构建了重组质粒pET32a（＋）-pilE;表达并纯化出35700Mr的目标蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的原核重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。成功纯化Ⅳ型菌毛蛋白PILE。     

人源脂肪细胞SH2B1β基因的克隆表达

目的获取人源脂肪细胞SH2B1β基因序列,构建SH2B1β-pET28a（＋）重组表达质粒,在大肠杆菌中对其进行表达。方法利用RT—PCR方法从人源分化成熟的脂肪细胞RNA中扩增出SH2B1β的cDNA片段．并插入pET28a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达带6xHis标签的融合蛋白。结果PCR和酶切电泳鉴定结果显示SH2B1β基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GenBank中的人源SH2B1β序列相符,SDS—PAGE电泳结果表明获得相对分子质量约75000的目的蛋白。结论成功获取了人源脂肪细胞的SH2B1β基因,并在BL21（DE3）中高效表达目的蛋白,为下一步表达纯化SH2B1β重组蛋白及蛋白的初步功能研究奠定基础。     

大肠杆菌表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份

目的 重组表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份。方法 采用DNA重组技术将尿素酶B亚单位3’端732bp基因片段克隆至pET11C载体上，转化宿主菌BL21（DE3）E.coli,IPTG诱导，SDS-PAGE及Western-blot分析表达情况。结果 成功构建了含UreB0.7kb片段的重组质粒pET-UreB0.7，并表达了具有免疫反应性的分子量约28000u的重组蛋白，表达率为19.8%。结论 重组的尿素酶B亚单位跨膜区成份为研究其相关生物学特性奠定了重要基础。亦可作为Hp疫苗的成分用于Hp感染的预防和治疗。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达情况。方法超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法（geneSOEing）剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST—Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α（＋）,构建重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,转化人大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β—D．半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS—PAGE和Westem—blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET32α（＋）中,SDS—PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000Mr的重组蛋白．与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22％：Western—blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原一件     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A（SRA）胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞（PBMC）中提取RNA,逆转录为eDNA,采用PCR技术从PBMC．eDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a（＋）,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni—NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blowing进行分析鉴定。FCM及EHSA方法检测SRA胞外段对ConA诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果PCR扩增得到长约1100bp的目的基因片段,插入pET41a（＋）载体所获重组表达载体pET41a—SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达。表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75000Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白．为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

尿激酶型纤溶酶原激活因子cDNA的克隆与原核表达

目的构建尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21中表达,为进一步研究uPA奠定基础。方法应用逆转录RT—PCR,从人肝细胞cDNA中扩增人尿激酶型纤溶酶原激活因子基因序列,与原核表达质粒pET32a重组,获得表达质粒uPA—pET32a。用氨苄青霉素平板筛选转化子。双酶切与DNA测序进行鉴定,用IPTG诱导表达,并用Westernblotting进行鉴定。结果从肝细胞cDNA中扩增的uPA基因片段长1296bp,酶切及DNA测序证实uPA-pET32a重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为68900Mr,经Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒uPA—pET32a。并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期的相一致．为进一步的研究奠定了基础。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的 构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bp RUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化Ecoli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和...     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。