山茱萸多糖对HDF细胞β-半乳糖苷酶及p16表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗HDF细胞衰老的作用及其可能的调控机制。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),实验组从40代开始加多糖含药血清,观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,分光光度法检测β-半乳糖苷酶活性,免疫组化法检测p16蛋白的表达。结果衰老组细胞活力下降,β-半乳糖苷酶含量升高,p16蛋白表达阳性细胞数升高;山茱萸多糖可提高细胞活力、降低β-半乳糖苷酶含量,p16蛋白表达阳性细胞数下降。结论山茱萸多糖可通过改变p16的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。     

黄芪血清药理对人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)抗衰老作用机制的研究

目的观察黄芪血清对人二倍体成纤维细胞（HDF）的抗衰老作用。方法以黄芪水煎剂灌胃家兔获得含药血清，以含黄芪血清的DMEM培养基培养HDF细胞，同时以不含黄芪的家兔血清作空白对照，测试HDF的部分衰老指标。结果含黄芪的培养基培养的HDF细胞与空白血清培养的HDF细胞比较群体倍增时间减少，细胞活力增加；衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA—β—gal）酶表达下降。结论含黄芪血清的培养基对HDF细胞具有一定的抗衰老作用。     

黄芪多糖对衰老HDF细胞染色体末端限制性片段长度的影响

目的探讨黄芪多糖(APS)改善衰老人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF细胞)衰老表型的机制。方法 HDF细胞连续传代培养,形成衰老细胞模型;采用MTT法检测细胞活力;免疫组化法检测β-半乳糖苷酶活性;DNA杂交法检测染色体末端限制性片段(TRF)长度。结果 APS提高衰老HDF细胞活力(P<0.05),降低了SA-β-gal表达(P<0.05);衰老HDF细胞TRF长度明显缩短(P<0.05),而APS可使TRF缩短速度降低(P<0.05)。结论 APS可以通过减慢TRF缩短速度,提高衰老HDF细胞活力,发挥抗衰老作用。     

D-半乳糖引起人正常二倍体细胞衰老的机制

目的 研究D-半乳糖处理后引起人正常二倍体细胞衰老的机制.方法 MTT法检测细胞存活率,衰老相关的β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,流式细胞术检测细胞内活性氧自由基水平,免疫印迹法检测衰老相关蛋白的表达.结果 D-半乳糖处理人胚胎肺细胞和肝细胞,均能抑制细胞的增殖.被处理的细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染为蓝色,细胞内活性氧自由基水平明显升高,衰老信号通路相关蛋白p53、p21、caviolin-1的表达均升高.结论 D-半乳糖引起人正常二倍体细胞出现典型的细胞衰老表型,可以作为衰老的可靠模型.     

阿司匹林抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用

目的 探讨阿司匹林是否具有抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用及其机制。方法 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分别于正常糖浓度培养液 （5.5 mmol/L）、高糖培养液和高糖（33 mmol/L）＋阿司匹林（0.01、0.1、1及3 mmol/L）培养液中培养48 h,观察细胞形态、采用β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,PCR-ELISA检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞内活性氧水平。结果 高糖培养液作用HUVEC 48 h后,细胞呈现衰老状态,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显增加,端粒酶活性明显减低,细胞周期停滞于G0/G1期,S期显著减少,细胞内活性氧水平显著增加。0.01、0.1和1 mmol/L阿司匹林作用后细胞形态改善,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著减少,端粒酶活性增强,S期细胞显著增加,细胞内活性氧水平降低（P<0.05）。而3 mmol/L阿司匹林作用后与高糖组相比差异无显著性。结论 高糖环境下阿司匹林（0.01、0.1和1 mmol/L）具有抗内皮细胞衰老的作用,其作用机制可能与氧化应激有关。     

阿司匹林抗高糖诱导内皮细胞衰老过程中对一氧化氮-一氧化氮合酶系统的影响

目的 探讨阿司匹林是否通过影响一氧化氮（NO）-一氧化氮合酶（NOS）系统发挥抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用. 方法 人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）分别于正常糖浓度培养液（5.5 mmol/L）、高糖培养液（33 mmol/L）、含阿司匹林（0.01～1mmol/L）培养液及含L-NAME（300 μmol/L）培养液中培养48 h.采用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平.Griess法检测细胞总NO水平,荧光酶标仪检测细胞内NOS活性.Westernblot分析eNOS蛋白及eNOS人丝氨酸（Ser-1177）蛋白表达. 结果 高糖作用内皮细胞48 h后与正常糖浓度相比,SA-β-gal阳性细胞数明显增多.阿司匹林剂量依赖性地减少SA-β-gal阳性细胞数,降低ROS的水平,升高NO的水平、总NOS活性和eNOS Ser-1177蛋白表达（P＜0.05）.L-NAME（NOS的抑制剂）能完全抑制高糖环境下阿司匹林的上述作用（P＜0.05）.各组间eNOS总蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）. 结论 高糖环境下阿司匹林通过提高细胞NOS活性而升高NO水平,降低氧化应激反应而发挥抗衰老作用.     

松花粉抗成纤维细胞复制性衰老的机制

目的 研究松花粉对衰老成纤维单细胞面积、β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)阳性率、p16INK4A和p21CIP-1表达以及细胞周期的影响.方法 以二倍体成纤维(2BS)细胞建立衰老细胞模型.生物体视学法分析单细胞面积变化;免疫组化法测SA-β-gal阳性率;流式细胞术分析细胞周期;RT-PCR法测定p16INK4A、p21CIP-1基因mRNA表达量.结果 56代细胞出现典型的衰老细胞形态改变,同时SA-β-gal染色阳性率与G1期细胞比例均增高.经松花粉处理后,衰老细胞的单细胞面积、SA-β-gal染色阳性率与G1期细胞比例均显著减少(P＜0.05);p16INK4A与p21CIP-1mRNA的表达量均较衰老模型组明显下调(P＜0.05). 结论松花粉具有改善细胞复制性衰老的作用,其分子机制可能与下调p16INK4A及p21CIP-1基因mRNA的表达从而改善衰老细胞G1期阻滞有关.     

Valsartan延缓血管内皮细胞衰老及p16INK4a表达变化的研究

目的 探讨Valsartan对血管内皮细胞衰老与p16INK4a表达变化的影响,为寻求廷缓内皮细胞衰老途径提供理论和实验依据.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,子血管紧张素Ⅱ及Valsartan干预,实验分为空白对照组、血管紧张素Ⅱ诱导组及Valsartan组,采用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定细胞衰老;流式细胞术分析细胞周期变化;免疫细胞化学染色法、Western blot分析各组细胞p16INK4a蛋白的表达.结果 与对照组比较,血管紧张素Ⅱ诱导组β-半乳糖苷酶阳性染色率显著增多81.24％±6.46％,细胞周期停滞于G0-G1(88.36％±6.45％),p16INK4a 蛋白表达水平上调(P＜0.05);予以Valsartan干预后,β-半乳糖苷酶阳性细胞染色率减少,G0-G1细胞减少,p16INK4a蛋白表达水平下调(P＜0.05).结论 血管内皮细胞衰老分子机制可能通过下调p16INK4a的表达,使细胞周期停滞于G1期有关,Valsartan对血管内皮细胞衰老有一定保护作用,可能通过调控p16INK4a的表达发挥其延缓3血管内皮细胞衰老的作用.     

细胞传代对SD大鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响

目的探究体外传代培养对SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)衰老的影响。方法全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,待细胞汇合率达80%～90%时,进行消化传代及纯化培养。对不同代数细胞,进行倒置显微镜下观察细胞形态学及生长特性,绘制1～7 d生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原标志物(CD29、CD45和CD90)和细胞周期,β-半乳糖苷酶染色并记录阳性细胞数,Western印迹法检测衰老相关蛋白P53和P21表达情况。结果 SD大鼠BMSCs的CD29、CD90高表达(95%),CD45低表达(5%),细胞周期中G0/G1期占87.37%;相较于P1～5代细胞,P7～9代细胞增殖能力明显下降,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多;随着传代次数的增加,BMSCs的P53、P21表达增高。结论体外培养传代次数的增加可导致SD大鼠BMSCs衰老。     

人高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白3对人成纤维细胞衰老进程的影响

目的 探讨人高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白3(hNaDC3)在人胚肺二倍体成纤维细胞(WI38)衰老中的作用。方法 通过构建逆转录病毒载体．使用含有hNaDC3基因的逆转录病毒液将hNaDC3基因导入WI-38中．并获得表达．观察其对WI-38细胞衰老的影响。结果 与对照细胞相比，hNaDC3基因导入后．WI-38细胞传代数减少10～13代，生长速率降低40％．细胞周期阻滞于G期，细胞形态呈衰老细胞样变化．衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性率上升-线粒体膜电位下降。结论 hNaDC3可能促进人WI-38衰老。     

何首乌饮对D-半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺β-半乳糖苷酶表达的影响

目的 通过观察何首乌饮干预的衰老大鼠下颌下腺β-半乳糖苷酶(β-gal)表达的改变,探讨何首乌饮的抗衰老作用.方法 用D-半乳糖制造衰老大鼠模型,何首乌饮的干预作用分治疗和预防两部分,检测β-半乳糖苷酶活性,观察下颌下腺衰老细胞数目改变.结果 预防性实验部分:模型组衰老细胞数目多于正常组和各预防性用药组;治疗性实验部分:用药各组与自然恢复组相比,衰老细胞数目明显减少,其中治疗中剂量组最低.结论 何首乌饮具有抗模型大鼠下颌下腺细胞衰老的作用.     

快速老化小鼠P8肾脏衰老的病理特点

目的 观察快速老化小鼠P8(SAMP8)肾脏病理结构改变.方法 以9月龄SAMP8为衰老动物模型,同龄抗快速老化小鼠R1(SAMR1)为对照,通过PAS、Masson染色及衰老相关β-半乳糖苷酶 (SA-β-gal) 组织化学染色观察肾脏组织病理的改变,免疫组化方法比较肾小管间质细胞外基质 (ECM)成分--纤维连接蛋白 (FN)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)的变化.结果 9月龄SAMP8小鼠光镜下肾脏病理表现为小管间质纤维化、局灶节段性肾小球硬化等,以小管间质损害较为显著;SA-β-gal染色阳性细胞显著增加;免疫组化结果显示FN、ColⅢ在肾小管间质过度沉积.上述改变与SAMR1组相比,差异有显著性.结论 SAMP8肾脏的病理改变符合肾脏衰老的特点.     

人参皂甙Rg3对血管平滑肌细胞衰老的影响及机制

目的探讨人参皂甙Rg3对D-半乳糖诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)衰老的影响及机制。方法取SD大鼠胸主动脉中层,分离并原代培养VSMC,选取3~6代VSMC,通过D-半乳糖共孵育的方法诱导细胞衰老,β-半乳糖苷酶染色和透射电镜鉴定衰老VSMC;VSMC随机分成对照组、D-半乳糖组、Rg3高浓度组、Rg3低浓度组,Western blot方法检测p16、p21和p53蛋白的表达水平,流式细胞术检测细胞周期。结果与对照组比较,D-半乳糖组β-半乳糖苷酶阳性细胞明显升高[(58.67±2.52)%vs(4.67±0.58)%,P<0.05]。电镜下表现为细胞核膜内折,细胞线粒体肿胀,脂褐素堆积;p16、p21和p53蛋白表达水平明显升高(P<0.05),细胞周期停滞在G0/G1期。与D-半乳糖组比较,Rg3低浓度组和Rg3高浓度组β-半乳糖苷酶阳性细胞明显减少,p16、p21和p53蛋白表达水平明显降低,G0/G1期细胞数明显减少(P<0.05)。结论人参皂甙Rg3可抑制VSMC衰老,其机制可能部分通过抑制细胞生长周期p16INK4a/Rb、p53-p21Cip1/Waf1信号通路来实现。     

双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用机制

目的 探讨双歧杆菌脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)在延缓H2O2诱导细胞衰老中的作用.方法 H2O2诱导WI-38细胞衰老,β-半乳糖苷酶细胞化学染色计算衰老细胞百分率变化,RT-PCR和Western印迹检测衰老细胞p21、细胞周期蛋白E(cyclin E)和周期蛋白依赖性蛋白激酶2(CDK2)表达水平的变化.结果 双歧杆菌LTA处理后,β-半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较衰老模型组降低(P＜0.01).与年轻对照组相比,衰老模型组细胞中p21的表达增高,cyclin E和CDK2表达降低,而双歧杆菌LTA能够逆转上述变化(P＜0.01).结论 双歧杆菌能延缓H2O2诱导的细胞衰老,机制可能与改变p21,cyclin E和CDK2表达水平有关.     

白藜芦醇通过抑制细胞凋亡延缓内皮细胞衰老

目的 探讨SIRT1在内皮细胞自然衰老过程中的变化和作用机制。方法 连续培养传代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）38代，选取第1、5、10、15、20、25、30和35代细胞做Western blot检测内皮细胞自然衰老过程中SIRT1蛋白含量变化以及Annexin V-FITC法测定内皮细胞凋亡水平变化。选取第25代细胞，给予SIRT1激动剂白藜芦醇（30 μmol/L）干预，β-半乳糖苷酶染色法检测内皮细胞的衰老程度以及Annexin V-FITC法测定内皮细胞凋亡水平。结果 随着代数增加，内皮细胞上的SIRT1蛋白表达逐渐降低（P<0.01），内皮细胞凋亡率逐渐升高（P<0.01）；给予第25代细胞白藜芦醇干预后，内皮细胞上的SIRT1表达升高（P<0.01），β-半乳糖苷酶阳性细胞率降低（P<0.01），凋亡率也降低（P<0.05）。结论 内皮细胞自然衰老过程中，SIRT1的表达会降低；给予白藜芦醇干预后，能逆转内皮细胞的衰老，其作用机制可能与SIRT1降低了内皮细胞凋亡水平有关。     

巴戟天对D-半乳糖致衰老大鼠心肌细胞肌球蛋白和肌动蛋白基因表达的影响

目的 探讨补肾益气中药巴戟天对衰老心肌细胞肌球蛋白和肌动蛋白基因表达的影响及其可能机制.方法 以新生24h内SD大鼠心脏组织为材料,采用胶原酶消化法分离并培养心肌细胞,用8 mg/ml的D-半乳糖诱导细胞2d并常规培养5 d制得心肌细胞衰老模型,并用巴戟天处理,观察作用.实验分为三组:对照组、模型组、巴戟天组.采用倒置显微镜观察细胞形态,生化方法检测β-半乳糖苷酶活力,MTT法测定细胞活力,RT-PCR检测肌球蛋白重链基因α-MHC和β-MHC mRNA表达,Western印迹方法检测肌动蛋白的蛋白表达.结果 ①与正常组相比,模型组细胞β-半乳糖苷酶活力显著性升高,细胞活力显著性降低,肌球蛋白重链α-MHC mRNA表达下降,肌球蛋白重链β-MHC mRNA表达升高;②巴戟天组与模型组相比较,一定程度上改变了衰老心肌细胞的形态变化,β-半乳糖苷酶的活力降低,细胞活力升高,肌球蛋白重链α-MHC mRNA表达上调,肌球蛋白重链β-MHC mRNA表达下调.α-actin蛋白表达在各用药组并未表现出显著性差异.结论 巴戟天能改善衰老心肌细胞α-MHC mRNA表达下调程度和β-MHC mRNA表达的上调程度.α-actin的表达保持恒定.     

miR-17-5p在不同代骨髓间充质干细胞中的表达

目的:观测miR-17-5p在年轻的和衰老骨髓间充质干细胞（BMMSCs）中的表达,并分析其与细胞衰老的相关性。方法:采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs并培养至第10代。取第4代（P4）BMMSCs和第10代（P10）BMMSCs的用细胞衰老β-半乳糖苷酶（β-gal）染色法进行染色。采用实时定量PCR检测P4及P10 BMMSCs中miR-17-5p基因的表达,并用2（-ΔΔct）法定量分析。结果:①形态学改变:P4～P10的细胞形态发生改变,P4的细胞形态均一,呈典型的漩涡状生长,P10的细胞失去典型的梭形外观,细胞体积增大而不规则,形状扁平破碎,细胞间隙增大,出现凋亡。②β-gal染色结果:P10的细胞肥大、染呈蓝色（呈阳性）,P4的细胞染色后未着色（呈阴性）。③实时定量PCR检测结果:P4细胞miR-17-5p基因的表达量是P10细胞的6.5倍（P<0.01）。结论:衰老BMMSCs中miR-17-5p的表达量显著降低,提示miR-17-5p可能参与了细胞的衰老过程。     

C1q/TNF相关蛋白3减轻氧化应激诱导的间充质干细胞衰老

目的建立间充质干细胞(MSCs)衰老模型,探讨C1q/TNF相关蛋白3(CTRP3)对衰老MSCs的作用并初步探讨机制。方法用过氧化氢(H_2O_2)诱导小鼠MSCs衰老,CCK8实验和β-半乳糖苷酶染色验证模型的建立。外源性给予CTRP3处理MSCs 24 h,CCK8实验检测增殖活性,β-半乳糖苷酶染色检测MSCs衰老,分化诱导实验检测MSCs分化能力,Western blotting法检测MSCs凋亡。RT-PCR检测MSCs中衰老相关基因P16、P21以及抗衰老基因SIRT1的mRNA表达变化。采用GraphPad Prism 6进行统计分析。组间比较采用方差分析或LSD两两比较。结果 H_2O_2可抑制MSCs的增殖活性,且呈浓度依赖性。与正常对照组相比,200μmol/L H_2O_2作用4 h,细胞立体感消失,细胞形态不规则;CCK8染色结果显示细胞增殖活性显著下降;β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著升高。继续CTRP3处理24 h后,衰老MSCs增殖和分化能力增强。Western blotting结果表明CTRP3可显著减低衰老MSCs的凋亡。RT-PCR检测发现CTRP3上调MSCs抗衰老基因SIRT1 mRNA表达,并且下调衰老相关基因P16、P21 mRNA的表达。结论 CTRP3可抑制MSCs衰老,SIRT1基因表达水平上调,及P16、P21基因表达水平下调可能是其重要机制。     

抑制细胞间通讯功能可加速人成纤维细胞的衰老

目的研究间隙连接蛋白connexin43在人成纤维细胞衰老过程中的调节作用。方法设计并合成针对人connexin43的双链RNA(siRNA),抑制人二倍体成纤维细胞WI-38细胞的connexin43表达和细胞间通讯功能,观察对其衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性率、细胞增殖能力、细胞周期调节蛋白P27、P21表达水平等衰老表型的影响。结果我们合成的siRNA-cx43可高效、特异的抑制connexin43 mRNA和蛋白质表达及细胞间通讯功能。转染WI-38细胞后,细胞增殖能力降低、细胞SA-β-gal染色阳性率(75.32±5.17)较对照组(32.48±3.94)和转染siRNA-con组(37.81±4.1 2)细胞升高(P<0.05),P27、P21表达增加,转染siRNA-cx43的WI-38细胞增殖能力显著降低,细胞变扁平、肥大,细胞SA-β-gal染色阳性率达100%,细胞提前出现衰老。结论间隙连接蛋白connexin43对WI-38细胞的衰老进程有重要的调节作用,其表达减少和细胞间通讯功能降低,可以促进WI-38细胞衰老进程。     

阿司匹林抗高糖诱导的内皮细胞衰老过程中对DDAH-ADMA系统及Caveolin-1蛋白的影响

目的观察阿司匹对高糖诱导的内皮细胞衰老模型二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)-非对称性二甲基精氨酸(ADMA)系统和Caveolin-1蛋白表达的影响,探讨阿司匹林抗高糖诱导内皮细胞衰老的机制。方法人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分别培养于正常糖浓度培养液(5.5 mmol/L)、高糖培养液(33 mmol/L)、高糖+阿司匹林(0.01~1 mmol/L)培养液以及含L-NAME(300μmol/L)培养液,48 h后采用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定衰老细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western blot分析Caveolin-1蛋白表达,液质联用仪检测细胞上清液中ADMA的含量并计算DDAH的活性。结果高糖作用内皮细胞48 h后,细胞β-gal染色阳性细胞数明显增多,ROS、ADMA水平以及Caveolin-1蛋白表达升高,DDAH活性降低。0.01~1 mmol/L阿司匹林剂量依赖性地降低β-gal染色阳性细胞数、ROS和ADMA水平以及Caveolin-1蛋白表达,同时升高细胞DDAH活性(P均0.05)。L-NAME(NOS的抑制剂)能完全抑制阿司匹林的上述作用(P0.05)。结论高糖环境下阿司匹林(0.01~1mmol/L)能抑制Caveolin-1表达,改善DDAH-ADMA系统的活性而进一步发挥抗氧化损伤、抗细胞衰老的作用。