高糖诱导人脐静脉内皮细胞衰老过程中活性氧与二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸系统的变化

目的 观察高糖加速内皮细胞衰老过程中细胞内活性氧(ROS)水平与二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸(DDAH-ADMA)系统的变化.方法 正常糖浓度培养液(5.5 mmol/L)和高糖培养液(11.0、22.0、33.0 mmol/L)作用于人脐静脉内皮细胞48 h后,用β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,液质联用仪检测细胞上清液中ADMA含量及DDAH活性.结果 与正常糖浓度组相比,11.0、22.0、33.0 mmol/L高糖浓度组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率明显增高[(7.00±1.73)%、(12.67±2.03)%、(16.00±2.26)%比(4.00±1.33)%,P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05],端粒酶活性显著下降[(91.32±4.01)%、(78.44±3.78)%、(56.04±3.35)%比100%,均P＜0.05];随细胞衰老程度加重,细胞内ROS水平(mfi)显著升高(159.84±27.52、188.99±18.77、244.56±20.96比117.11±18.76,P＜0.05或P＜0.01),ADMA水平(μmol/L)显著升高(0.78±0.14、0.88±0.18、1.08±0.15比0.70±0.12,P＞0.05、P＜0.05、P＜0.05),DDAH活性显著下降[(91.32±4.01)%、(78.44±3.78)%、(56.04±3.35)%比100%,均P＜0.05].结论 高糖可加速内皮细胞衰老进程,其机制可能与氧化应激水平增强、抑制DDAH活性使ADMA含量增加有关.

Abstract：

Objective To investigate the changes in reactive oxygen species (ROS) and dimethylarginine dimethylaminohydrolase-asymmetric dimethylarginine (DDAH-ADMA) system in the process of endothelial cell senescence after exposure to high glucose. Methods The human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured with different concentrations of glucose, e.g. 5. 5 mmol/L (normal level),and high levels as 11. 0, 22. 0 and 33. 0 mmol/L. for 48 hours, respectively. Subsequently, SA-β-gal staining was used to evaluate senescence of cells. Telomerase activity was detected by polymerase chain reactionenzyme linked immunosorbent assay (PCR-ELISA). The intracellular ROS level was measured by flow cytometry. The ADMA concentration and DDAH activity were determined with high-performance liquid chromatography. Results Compared with normal glucose concentration group, after the endothelial cells were treated with high glucose concentration (11. 0 - 33. 0 mmol/L) for 48 hours, the number of SA-β-gal positive cells was increased significantly [(7.00±1. 73)%, (12. 67±2. 03)%, (16. 00±2. 26)% vs. (4. 00±1.33)%, P＞0.05, P＜0.05, P＜0.05] and the telomerase activity was inhibited dramatically [(91. 32±4.01)%, (78. 44±3. 78)%, (56. 04±3. 35)% vs. 100%, all P＜0. 05]. The ROS level (mfi) was increased in all high glucose groups (159. 84±27. 52, 188. 99±18. 77, 244. 56±20. 96 vs. 117.11±18. 76, P＜0. 05 or P＜0. 01). At the same time, the ADMA (μmol/L) production was increased (0. 78±0. 14, 0. 88±0.18,1. 08±0.15 vs. 0. 70±0. 12, P＞0. 05, P＜0. 05, P＜0. 05), and DDAH activity was decreased [(91. 32±4.01)%, (78.44±3.78)%, (56. 04± 3. 35)% vs. 100%, all P＜0.05]. Conclusion High glucose can accelerate endothelial cells senescence in dose-dependent manner and the underlying mechanism may be related to an increased oxidative stress and change in DDAH-ADMA system.     

黄芪复方对实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠神经肌肉接头超声微结构的影响

目的复制实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠,观察中药黄芪复方干预后其神经肌肉接头超微结构的变化.方法实验于2001-01/2004-12在辽宁中医药大学附属医院完成.①选取雌性Lewis大鼠24只,随机数字表法分为模型组、正常组、中药组、西药组,6只/组.②电鳐购于美国加州,捕捞后取出电器官空运,-60℃冻存.用冷磷酸盐缓冲液将电鳐的电器官制成匀浆,制备粗提物,亲和层析技术分离提纯乙酰胆碱受体用于大鼠免疫.③除正常组外,其余组均将含有30μg乙酰胆碱受体的弗氏完全佐剂200μL注射于鼠两后足垫皮内进行初次免疫,3周后行二次免疫,将含有20 μg乙酰胆碱受体的弗氏完全佐剂200μL注射于鼠两前足垫皮内,建立实验性自身免疫性重症肌无力动物模型.④初次免疫后,观察各组大鼠肌无力症状(叫声低微与活动减少是判断实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的首发症状),并根据Lennon标准进行评分(分为0～3分,分数越高代表症状越严重).肌电图的改变亦是判断模型建立的重要指标,故采用肌电图检测重症肌无力衰减程度,以(第5个反应波幅-第1个反应波幅)/第1个反应波幅×100%表示.⑤成模后给予药物治疗.中药组灌胃给予自拟黄芪复方(黄芪、白术、枸杞、何首乌、枳壳、升麻)8.4g/(kg·d);西药组灌胃给予强的松片5.4 mg/(kg·d);正常组及模型组均灌胃给予等体积生理盐水.各组给药1次/d,连续1个月.处死大鼠,电镜下观察神经肌肉接头超微结构的变化.结果模型组2只、西药组1只大鼠因肌无力症状恶化于初次免疫后第3周死亡脱落,共21只大鼠进入结果分析.①肌无力症状Lennon标准检测结果模型组、中药组、西药组大鼠于初次免疫后17 d开始相继出现体质量下降、活动减少、叫声低微等肌无力症状,按Lennon分级评为1分;3只症状迅速恶化,呈濒死态,评为3分,随后1周内相继死亡,其余大鼠呈慢性发病.正常组大鼠均无肌无力症状表现.②重症肌无力肌电图检测结果初次免疫后第4,8周,正常组大鼠腓肠肌电图波幅均无明显变化;而模型组、中药组、西药组大鼠肌电图波幅衰退程度均大于15%,证明造模成功.③给药1个月后各组大鼠神经肌肉接头超微结构电镜结果正常组突触前、后膜结构完好;模型组突触间隙加大,神经肌肉接头褶排列紊乱,局部溶解消失,突触小泡数量减少;中药组出现新生轴突终末分支,内含丰富的突触小泡;西药组则无新生轴突,神经肌肉接头褶排列紊乱、溶解消失,突触前部线粒体及其他细胞器空泡化依然明显.结论实验性自身免疫性重症肌无力动物模型经中药黄芪复方治疗后,可促进其神经肌肉接头新生轴突的产生,并增加突触小泡数量,从而减轻突触损伤.     

黄芪复方对实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠神经肌肉接头超微结构的影响

目的:复制实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠,观察中药黄芪复方干预后其神经肌肉接头超微结构的变化。方法:实验于2001-01/2004-12在辽宁中医药大学附属医院完成。①选取雌性Lewis大鼠24只,随机数字表法分为模型组、正常组、中药组、西药组,6只/组。②电鳐购于美国加州,捕捞后取出电器官空运,-60℃冻存。用冷磷酸盐缓冲液将电鳐的电器官制成匀浆,制备粗提物,亲和层析技术分离提纯乙酰胆碱受体用于大鼠免疫。③除正常组外,其余组均将含有30μg乙酰胆碱受体的弗氏完全佐剂200μL注射于鼠两后足垫皮内进行初次免疫,3周后行二次免疫,将含有20μg乙酰胆碱受体的弗氏完全佐剂200μL注射于鼠两前足垫皮内,建立实验性自身免疫性重症肌无力动物模型。④初次免疫后,观察各组大鼠肌无力症状(叫声低微与活动减少是判断实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的首发症状),并根据Lennon标准进行评分(分为0～3分,分数越高代表症状越严重)。肌电图的改变亦是判断模型建立的重要指标,故采用肌电图检测重症肌无力衰减程度,以(第5个反应波幅-第1个反应波幅)/第1个反应波幅×100%表示。⑤成模后给予药物治疗。中药组灌胃给予自拟黄芪复方(黄芪、白术、枸杞、何首乌、枳壳、升麻)8.4g/(kg·d);西药组灌胃给予强的松片5.4mg/(kg·d);正常组及模型组均灌胃给予等体积生理盐水。各组给药1次/d,连续1个月。处死大鼠,电镜下观察神经肌肉接头超微结构的变化。结果:模型组2只、西药组1只大鼠因肌无力症状恶化于初次免疫后第3周死亡脱落,共21只大鼠进入结果分析。①肌无力症状Lennon标准检测结果:模型组、中药组、西药组大鼠于初次免疫后17d开始相继出现体质量下降、活动减少、叫声低微等肌无力症状,按Lennon分级评为1分;3只症状迅速恶化,呈濒死态,评为3分,随后1周内相继死亡,其余大鼠呈慢性发病。正常组大鼠均无肌无力症状表现。②重症肌无力肌电图检测结果:初次免疫后第4,8周,正常组大鼠腓肠肌电图波幅均无明显变化;而模型组、中药组、西药组大鼠肌电图波幅衰退程度均大于15%,证明造模成功。③给药1个月后各组大鼠神经肌肉接头超微结构电镜结果:正常组突触前、后膜结构完好;模型组突触间隙加大,神经肌肉接头褶排列紊乱,局部溶解消失,突触小泡数量减少;中药组出现新生轴突终末分支,内含丰富的突触小泡;西药组则无新生轴突,神经肌肉接头褶排列紊乱、溶解消失,突触前部线粒体及其他细胞器空泡化依然明显。结论:实验性自身免疫性重症肌无力动物模型经中药黄芪复方治疗后,可促进其神经肌肉接头新生轴突的产生,并增加突触小泡数量,从而减轻突触损伤。     

冠心康对高脂血症兔血管LOX-1表达的影响

目的观察冠心康对高脂血症兔主动脉血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（lectin—like low density lipoprotein receptor-1，LOX1）表达的影-响。方法24只兔随机分三组：空白组，模型组，冠心康干预组，喂食高脂饲料方法建立兔高脂血症模型。分别于0周、8周时耳中央动脉采血检测血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL—C）水平。8周时处死动物，RT—PCR法检测兔主动脉LOX-1 mRNA表达，免疫组化法检测主动脉LOX-1蛋白表达。结果高脂组血管LOX-1表达显著增加，与之对比，冠心康明显下调了血管LOX-1的表达水平（P〈0．05）。结论冠心康的抗动脉粥样硬化（Atheroscierosis，AS）作用，部分是通过下调LOX-1表达实现的。     

同型半胱氨酸对脐静脉内皮细胞线粒体膜电位及活性氧生成的影响

目的 探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的损伤作用及机制.方法 培养(HUVEC),以不同浓度Hcy(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmoVL、1 mmol/L、3 mmol/L和5mmol/L)和不同的作用时间(3 h、6 h、12 h、24 h)进行干预.流式细胞仪观察...     

高糖诱导人脐静脉内皮细胞衰老过程中活性氧和一氧化氮合酶／一氧化氮系统的变化

目的 观察高糖加速内皮细胞衰老过程中细胞内活性氧(ROS)水平和一氧化氮合酶/一氧化氮(NOS/NO)系统的变化.方法 将正常浓度糖(5.5 mmol/L)和高浓度糖(分别为11、22、33 mmol/L)培养液作用于人脐静脉内皮细胞48 h后,用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定衰老细胞,用聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)检测端粒酶活性,用硝酸盐还原酶法检测细胞上清液总NO水平,用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)分析内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达,用荧光酶标仪检测细胞内NOS活性,用流式细胞仪检测细胞内ROS水平.结果 高糖培养液作用于内皮细胞48 h后,与对照组比较,随糖浓度升高内皮细胞β-gal染色阳性细胞数明显增多,端粒酶活性下降,细胞NO合成减少,NOS活性被抑制,细胞内ROS水平明显升高(P<0.05或P<0.01),但eNOS蛋白表达变化不明显.结论 高糖加速内皮细胞衰老进程,其作用机制可能与增强氧化应激,抑制NOS/NO系统有关.     

阿司匹林抗高糖诱导内皮细胞衰老过程中对一氧化氮-一氧化氮合酶系统的影响

目的 探讨阿司匹林是否通过影响一氧化氮（NO）-一氧化氮合酶（NOS）系统发挥抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用. 方法 人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）分别于正常糖浓度培养液（5.5 mmol/L）、高糖培养液（33 mmol/L）、含阿司匹林（0.01～1mmol/L）培养液及含L-NAME（300 μmol/L）培养液中培养48 h.采用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平.Griess法检测细胞总NO水平,荧光酶标仪检测细胞内NOS活性.Westernblot分析eNOS蛋白及eNOS人丝氨酸（Ser-1177）蛋白表达. 结果 高糖作用内皮细胞48 h后与正常糖浓度相比,SA-β-gal阳性细胞数明显增多.阿司匹林剂量依赖性地减少SA-β-gal阳性细胞数,降低ROS的水平,升高NO的水平、总NOS活性和eNOS Ser-1177蛋白表达（P＜0.05）.L-NAME（NOS的抑制剂）能完全抑制高糖环境下阿司匹林的上述作用（P＜0.05）.各组间eNOS总蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）. 结论 高糖环境下阿司匹林通过提高细胞NOS活性而升高NO水平,降低氧化应激反应而发挥抗衰老作用.     

糖尿病大鼠血、尿TGF-β1的相关性及糖肾安对其表达的影响

目的:观察糖尿病大鼠血、尿TGF-β1的变化,探讨其相关性以及糖肾安煎剂对血、尿TGF-β1表达的影响。方法:STZ诱导的糖尿病大鼠给予糖肾安治疗8周后,检测大鼠血、尿TGF-β1、尿mALB水平,HE、PAS染色观察肾组织的病理学改变。结果:模型组大鼠血、尿TGF-β1、尿mALB明显高于空白对照组(P0.01),中药组、西药组明显低于模型组(P0.01),与空白对照组比较无统计学差异(P0.05)。各组大鼠血、尿TGF-β1均呈显著正相关。HE染色中药组、西药组肾小球毛细血管壁狭窄甚至闭塞较模型组减轻。PAS染色模型组肾小球基底膜成分明显增加,而中药组、西药组的基底膜成分较模型组明显降低。结论:糖肾安煎剂能降低尿mALB水平,减轻肾脏组织病理学改变,其肾脏保护作用可能与调节TGF-β1水平有关。     

木丹颗粒对2型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度及血浆炎症因子水平的影响

目的观察木丹颗粒对2型糖尿病(T2DM)患者颈动脉内膜中层厚度及血浆炎症因子(C-RP)水平的影响。方法将符合2型糖尿病诊断标准的67例患者随机分为两组,两组控制血糖基础治疗相同,中药组配合中药木丹颗粒。结果①中药组治疗后FPG,2hPG,血脂TC、TG,LDL-C、BMI水平均下降,但没有统计学意义,而HDL-C则升高,亦没有统计学意义;②T2DM组的C-RP水平、IMT均高于中药组(P<0.05)。结论木丹颗粒通过减轻血管炎症反应,减缓动脉硬化的进程,从而可以延缓糖尿病大血管并发症发生及发展。     

基于中观、微观“气化”理论探讨桥本甲状腺炎的发病机制

气化理论是《黄帝内经》中记载,用以阐释生命过程、疾病的中医机制。中医多认为桥本甲状腺炎（HT）的病机与外邪侵袭、水土失宜或情志内伤,肝失疏泄,或因先天不足,或因后天失养,从而产生气滞、痰凝、血瘀等病理产物壅结于颈前有关。气化以气机调畅为基础和前提,中观、微观气化与人体关系密切,可分别在精微物质生成、精微物质代谢、病理形态、经络上对HT产生一定的影响。因此文章基于中观、微观“气化”探讨环境及肝脾肾失调对HT发病的影响。基于中观气化理论,HT的发病核心病机以外邪侵袭,水土、饮食失宜为主;基于微观气化理论,HT的发病核心病机为肝脾肾失调。从先天不足、后天失养（精气不足,津血乏源）,肝失疏泄,气机失调（气滞血瘀,水停精滞）;或留滞不化,结聚成形;或经络失养、涩滞不行探讨HT的发病机制,以期开创以气化理论为基础的HT中医治疗新思路。