黄芪多糖对衰老HDFβ-半乳糖苷酶活性影响的实验研究

目的 探讨黄芪多糖（APS）对衰老人胚肺二倍体成纤维细胞（HDF）衰老相关β-半乳糖苷酶（SAβ-gal）活性的影响.方法 MTT法测细胞活力;免疫组化法测衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数.结果 黄芪多糖可以增强细胞活力,降低SAβ-gal染色阳性细胞数.结论 黄芪多糖延缓HDF细胞衰老的机制之一可能是减少了SAβ-gal的表达.     

人参皂甙Rg3对血管平滑肌细胞衰老的影响及机制

目的探讨人参皂甙Rg3对D-半乳糖诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)衰老的影响及机制。方法取SD大鼠胸主动脉中层,分离并原代培养VSMC,选取3~6代VSMC,通过D-半乳糖共孵育的方法诱导细胞衰老,β-半乳糖苷酶染色和透射电镜鉴定衰老VSMC;VSMC随机分成对照组、D-半乳糖组、Rg3高浓度组、Rg3低浓度组,Western blot方法检测p16、p21和p53蛋白的表达水平,流式细胞术检测细胞周期。结果与对照组比较,D-半乳糖组β-半乳糖苷酶阳性细胞明显升高[(58.67±2.52)%vs(4.67±0.58)%,P<0.05]。电镜下表现为细胞核膜内折,细胞线粒体肿胀,脂褐素堆积;p16、p21和p53蛋白表达水平明显升高(P<0.05),细胞周期停滞在G0/G1期。与D-半乳糖组比较,Rg3低浓度组和Rg3高浓度组β-半乳糖苷酶阳性细胞明显减少,p16、p21和p53蛋白表达水平明显降低,G0/G1期细胞数明显减少(P<0.05)。结论人参皂甙Rg3可抑制VSMC衰老,其机制可能部分通过抑制细胞生长周期p16INK4a/Rb、p53-p21Cip1/Waf1信号通路来实现。     

D-半乳糖引起人正常二倍体细胞衰老的机制

目的 研究D-半乳糖处理后引起人正常二倍体细胞衰老的机制.方法 MTT法检测细胞存活率,衰老相关的β-半乳糖苷酶染色鉴定衰老细胞,流式细胞术检测细胞内活性氧自由基水平,免疫印迹法检测衰老相关蛋白的表达.结果 D-半乳糖处理人胚胎肺细胞和肝细胞,均能抑制细胞的增殖.被处理的细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染为蓝色,细胞内活性氧自由基水平明显升高,衰老信号通路相关蛋白p53、p21、caviolin-1的表达均升高.结论 D-半乳糖引起人正常二倍体细胞出现典型的细胞衰老表型,可以作为衰老的可靠模型.     

山茱萸多糖对衰老HDF细胞cyclinD1、CDK4表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗人胚肺成纤维二倍体（HDF）细胞衰老的作用及其可能的细胞周期调控机制。方法体外培养HDF细／胞，实验组从40代开始加山茱萸多糖含药血清。观察细胞形态；MTr法检测细胞活力；RT—PCR法检测细胞周期蛋白（cyclin）D1、细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）4的mRNA表达。结果衰老组细胞活力下降，cyclinD1 mRNA表达升高，CDK4mRNA表达下降；山茱萸多糖可提高细胞活力，降低cy—dinD1表达，提高CDK4表达量。结论山茱萸多糖可能通过改变细胞周期调控因子的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。     

巴戟天对D-半乳糖致衰老大鼠心肌细胞肌球蛋白和肌动蛋白基因表达的影响

目的 探讨补肾益气中药巴戟天对衰老心肌细胞肌球蛋白和肌动蛋白基因表达的影响及其可能机制.方法 以新生24h内SD大鼠心脏组织为材料,采用胶原酶消化法分离并培养心肌细胞,用8 mg/ml的D-半乳糖诱导细胞2d并常规培养5 d制得心肌细胞衰老模型,并用巴戟天处理,观察作用.实验分为三组:对照组、模型组、巴戟天组.采用倒置显微镜观察细胞形态,生化方法检测β-半乳糖苷酶活力,MTT法测定细胞活力,RT-PCR检测肌球蛋白重链基因α-MHC和β-MHC mRNA表达,Western印迹方法检测肌动蛋白的蛋白表达.结果 ①与正常组相比,模型组细胞β-半乳糖苷酶活力显著性升高,细胞活力显著性降低,肌球蛋白重链α-MHC mRNA表达下降,肌球蛋白重链β-MHC mRNA表达升高;②巴戟天组与模型组相比较,一定程度上改变了衰老心肌细胞的形态变化,β-半乳糖苷酶的活力降低,细胞活力升高,肌球蛋白重链α-MHC mRNA表达上调,肌球蛋白重链β-MHC mRNA表达下调.α-actin蛋白表达在各用药组并未表现出显著性差异.结论 巴戟天能改善衰老心肌细胞α-MHC mRNA表达下调程度和β-MHC mRNA表达的上调程度.α-actin的表达保持恒定.     

Valsartan延缓血管内皮细胞衰老及p16INK4a表达变化的研究

目的 探讨Valsartan对血管内皮细胞衰老与p16INK4a表达变化的影响,为寻求廷缓内皮细胞衰老途径提供理论和实验依据.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,子血管紧张素Ⅱ及Valsartan干预,实验分为空白对照组、血管紧张素Ⅱ诱导组及Valsartan组,采用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定细胞衰老;流式细胞术分析细胞周期变化;免疫细胞化学染色法、Western blot分析各组细胞p16INK4a蛋白的表达.结果 与对照组比较,血管紧张素Ⅱ诱导组β-半乳糖苷酶阳性染色率显著增多81.24％±6.46％,细胞周期停滞于G0-G1(88.36％±6.45％),p16INK4a 蛋白表达水平上调(P＜0.05);予以Valsartan干预后,β-半乳糖苷酶阳性细胞染色率减少,G0-G1细胞减少,p16INK4a蛋白表达水平下调(P＜0.05).结论 血管内皮细胞衰老分子机制可能通过下调p16INK4a的表达,使细胞周期停滞于G1期有关,Valsartan对血管内皮细胞衰老有一定保护作用,可能通过调控p16INK4a的表达发挥其延缓3血管内皮细胞衰老的作用.     

灵芝多糖抗H2O2诱导的HDF细胞衰老及其机制的研究

目的 探讨不同剂量灵芝多糖(GLP)对抗H2O2诱导的HDF细胞衰老及可能的细胞周期调控机制.方法 将HDF细胞培养至24代时分成6组:即青年组、对照组、衰老模型组及GLP小剂量(50 mg/L)、中剂量(100 mg/L)、大剂量(150 mg/L)组,体外DMEM培养,各GLP组和衰老模型组自30代始添加 H2O2诱导HDF细胞衰老,直至38代.采用MTT法检测细胞活力;Dimri法检测β-半乳糖苷酶活性;RT-PCR法检测p16INK4a、CyclinD1、CDK4的表达;Western印迹法检测Rb蛋白表达和磷酸化Rb.结果 与青年组及对照组比较,衰老模型组细胞活力下降(P＜0.01),β-半乳糖苷酶活性升高(P＜0.01),CyclinD1 mRNA表达升高(P＜0.01),CDK4 mRNA表达下降(P＜0.01),p16INK4a表达升高(P＜0.01),Rb磷酸化减少(P＜0.01);与衰老模型组细胞比较,中剂量和大剂量GLP细胞活力明显提高(均P＜0.01),而β-半乳糖苷酶活性降低(均P＜0.01),CyclinD1 mRNA表达降低(均P＜0.01),CDK4 mRNA表达升高(均P＜0.01),p16INK4a表达降低,Rb磷酸化增多(均P＜0.01),但两组之间差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 GLP可通过改变细胞周期调控因子CyclinD1/CDK4/p16INK4a进而调节Rb的磷酸化状态,发挥抗H2O2诱导的HDF细胞衰老作用.     

黄芪血清药理对人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)抗衰老作用机制的研究

目的观察黄芪血清对人二倍体成纤维细胞（HDF）的抗衰老作用。方法以黄芪水煎剂灌胃家兔获得含药血清，以含黄芪血清的DMEM培养基培养HDF细胞，同时以不含黄芪的家兔血清作空白对照，测试HDF的部分衰老指标。结果含黄芪的培养基培养的HDF细胞与空白血清培养的HDF细胞比较群体倍增时间减少，细胞活力增加；衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA—β—gal）酶表达下降。结论含黄芪血清的培养基对HDF细胞具有一定的抗衰老作用。     

睾酮对亚急性衰老小鼠下丘脑的影响及其机制

目的观察低刘量睾酮对小鼠下丘脑衰老的影响及其可能的调控机制。方法将24只健康雄性C57小鼠随机分为3组:D-半乳糖+睾酮治疗组(治疗组)、D-半乳糖组和正常对照组,每组8只。用药5个月后分离小鼠下丘脑组织,制备石蜡切片,测定小鼠下丘脑衰老相关性β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色情况,用免疫组织化学法检测p16~(INK4a)蛋白的表达水平。结果与正常对照组比较,D-半乳糖组小鼠体重降低(P<0.05),下丘脑SA-β-Gal染色阳性细胞率和p16~(INK4a)蛋白阳性细胞率明显升高(P<0.05);与D-半乳糖组比较,治疗组小鼠体重增加(P<0.05).下丘脑SA-β-Gal染色阳性细胞率和p16~(INK4a)蛋白阳性细胞率明显降低(P<0.05)。结论低剂量睾酮可能通过改变p16~(INK4a)的表达而发挥抗下丘脑细胞衰老的作用。     

抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对冈田酸诱导原代星形胶质细胞衰老情况的影响

目的 研究冈田酸(OA)诱导的原代星形胶质细胞中通过抑制磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/糖原合成激酶(GSK)-3β信号通路对p21、p53衰老蛋白表达水平和衰老阳性细胞表达的影响，探讨OA诱导星形胶质细胞衰老情况及相关机制。方法 免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞，CCK8法筛选OA药物浓度，然后用LY294002、OA分别处理或联合处理细胞，Western印迹测定细胞中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平的变化及β-半乳糖苷酶染色检测衰老阳性细胞。结果 免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞结果显示其纯度达到95%以上，CCK8法筛选出OA药物处理浓度为30 nmol/L,OA组中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达较正常对照组显著升高(P<0.05),衰老阳性细胞数明显增加，但LY294002+OA组p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平较OA组明显降低，并且衰老阳性细胞数也明显减少(P<0.05)。结论 通过OA处理能使星形胶质细胞发生衰老，LY294002处理能通...     

双歧杆菌脂磷壁酸延缓细胞衰老的作用机制

目的 探讨双歧杆菌脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)在延缓H2O2诱导细胞衰老中的作用.方法 H2O2诱导WI-38细胞衰老,β-半乳糖苷酶细胞化学染色计算衰老细胞百分率变化,RT-PCR和Western印迹检测衰老细胞p21、细胞周期蛋白E(cyclin E)和周期蛋白依赖性蛋白激酶2(CDK2)表达水平的变化.结果 双歧杆菌LTA处理后,β-半乳糖苷酶细胞化学染色阳性细胞百分率较衰老模型组降低(P＜0.01).与年轻对照组相比,衰老模型组细胞中p21的表达增高,cyclin E和CDK2表达降低,而双歧杆菌LTA能够逆转上述变化(P＜0.01).结论 双歧杆菌能延缓H2O2诱导的细胞衰老,机制可能与改变p21,cyclin E和CDK2表达水平有关.     

C1q/TNF相关蛋白3减轻氧化应激诱导的间充质干细胞衰老

目的建立间充质干细胞(MSCs)衰老模型,探讨C1q/TNF相关蛋白3(CTRP3)对衰老MSCs的作用并初步探讨机制。方法用过氧化氢(H_2O_2)诱导小鼠MSCs衰老,CCK8实验和β-半乳糖苷酶染色验证模型的建立。外源性给予CTRP3处理MSCs 24 h,CCK8实验检测增殖活性,β-半乳糖苷酶染色检测MSCs衰老,分化诱导实验检测MSCs分化能力,Western blotting法检测MSCs凋亡。RT-PCR检测MSCs中衰老相关基因P16、P21以及抗衰老基因SIRT1的mRNA表达变化。采用GraphPad Prism 6进行统计分析。组间比较采用方差分析或LSD两两比较。结果 H_2O_2可抑制MSCs的增殖活性,且呈浓度依赖性。与正常对照组相比,200μmol/L H_2O_2作用4 h,细胞立体感消失,细胞形态不规则;CCK8染色结果显示细胞增殖活性显著下降;β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著升高。继续CTRP3处理24 h后,衰老MSCs增殖和分化能力增强。Western blotting结果表明CTRP3可显著减低衰老MSCs的凋亡。RT-PCR检测发现CTRP3上调MSCs抗衰老基因SIRT1 mRNA表达,并且下调衰老相关基因P16、P21 mRNA的表达。结论 CTRP3可抑制MSCs衰老,SIRT1基因表达水平上调,及P16、P21基因表达水平下调可能是其重要机制。     

硫化氢通过SIRT1抗内皮细胞衰老

目的探讨外源性硫化氢在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老中的作用及分子机制。方法用25μmol/L H2O2诱导HUVEC衰老,通过检测β-半乳糖苷酶计算细胞衰老率。检测不同浓度(15、30、60及120μmol/L)的硫氢化钠作用下内皮细胞衰老标志物β-半乳糖苷酶的表达,Western blot分析沉默信息调节因子1(SIRT1)蛋白的表达。结果 HUVEC经25μmol/L H2O2处理1 h后,β-半乳糖苷酶阳性细胞率为12.2%±1.30%;经60μmol/L硫氢化钠干预48 h后,β-半乳糖苷酶阳性细胞率显著降低,为4.6%±1.14%,两组相比差异显著(P<0.05);与对照组比较,60μmol/L硫氢化钠干预48 h后SIRT1蛋白表达显著上调(P<0.05),而用SIRT1抑制剂(NAM)可减弱硫氢化钠此作用(β-半乳糖苷酶阳性细胞率为12.0%±1.58%)。结论硫化氢能通过上调SIRT1表达抵抗H2O2诱导HUVEC衰老。     

白藜芦醇对氧化应激环境中HUVECs细胞衰老、增殖、凋亡的影响及机制

目的探讨白藜芦醇(RSV)在氧化应激环境中对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)衰老、增殖及凋亡的影响,并对相关机制进行探索。方法利用β-半乳糖苷酶染色HUVECs衰老的细胞并记录阳性细胞数,观察过氧化氢(H_2O_2)单独处理以及联合RSV后,细胞衰老情况的变化;采用长时程动态活细胞成像及分析系统检测H_2O_2单独处理以及联合RSV后细胞增殖能力的变化并绘制生长曲线;利用流式细胞技术检测H_2O_2单独及联合RSV对HUVECs细胞周期及细胞凋亡情况的影响;采用Western印迹检测相关蛋白表达情况。结果 HUVECs经H_2O_2处理后,相比于H_2O_2组,RSV组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例明显减低,细胞增殖能力增强,二者差异显著(P0.05);相比于RSV组,H_2O_2组细胞周期多被阻滞在G1期,且细胞增殖相关蛋白(p-AKT和pERK)表达减少,而衰老相关蛋白p53、 p21、 p16、 p-Rb表达明显增多;而RSV可拮抗H_2O_2对HUVECs的作用,使HUVECs凋亡细胞数显著减少,Survivin蛋白表达明显增多(P0.05)。结论 RSV可抑制氧化应激环境中HUVECs细胞的衰老及凋亡、促进细胞增殖,对HUVECs细胞具有保护作用,其机制与RSV改变相关蛋白表达有关。     

黄芪多糖对衰老HDF细胞染色体末端限制性片段长度的影响

目的探讨黄芪多糖(APS)改善衰老人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF细胞)衰老表型的机制。方法 HDF细胞连续传代培养,形成衰老细胞模型;采用MTT法检测细胞活力;免疫组化法检测β-半乳糖苷酶活性;DNA杂交法检测染色体末端限制性片段(TRF)长度。结果 APS提高衰老HDF细胞活力(P<0.05),降低了SA-β-gal表达(P<0.05);衰老HDF细胞TRF长度明显缩短(P<0.05),而APS可使TRF缩短速度降低(P<0.05)。结论 APS可以通过减慢TRF缩短速度,提高衰老HDF细胞活力,发挥抗衰老作用。     

细胞传代对SD大鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响

目的探究体外传代培养对SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)衰老的影响。方法全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,待细胞汇合率达80%～90%时,进行消化传代及纯化培养。对不同代数细胞,进行倒置显微镜下观察细胞形态学及生长特性,绘制1～7 d生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原标志物(CD29、CD45和CD90)和细胞周期,β-半乳糖苷酶染色并记录阳性细胞数,Western印迹法检测衰老相关蛋白P53和P21表达情况。结果 SD大鼠BMSCs的CD29、CD90高表达(95%),CD45低表达(5%),细胞周期中G0/G1期占87.37%;相较于P1～5代细胞,P7～9代细胞增殖能力明显下降,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多;随着传代次数的增加,BMSCs的P53、P21表达增高。结论体外培养传代次数的增加可导致SD大鼠BMSCs衰老。     

白藜芦醇通过抑制细胞凋亡延缓内皮细胞衰老

目的 探讨SIRT1在内皮细胞自然衰老过程中的变化和作用机制。方法 连续培养传代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）38代，选取第1、5、10、15、20、25、30和35代细胞做Western blot检测内皮细胞自然衰老过程中SIRT1蛋白含量变化以及Annexin V-FITC法测定内皮细胞凋亡水平变化。选取第25代细胞，给予SIRT1激动剂白藜芦醇（30 μmol/L）干预，β-半乳糖苷酶染色法检测内皮细胞的衰老程度以及Annexin V-FITC法测定内皮细胞凋亡水平。结果 随着代数增加，内皮细胞上的SIRT1蛋白表达逐渐降低（P<0.01），内皮细胞凋亡率逐渐升高（P<0.01）；给予第25代细胞白藜芦醇干预后，内皮细胞上的SIRT1表达升高（P<0.01），β-半乳糖苷酶阳性细胞率降低（P<0.01），凋亡率也降低（P<0.05）。结论 内皮细胞自然衰老过程中，SIRT1的表达会降低；给予白藜芦醇干预后，能逆转内皮细胞的衰老，其作用机制可能与SIRT1降低了内皮细胞凋亡水平有关。     

基于自噬与凋亡平衡探讨补肾活血汤对衰老耳蜗毛细胞株HEI-OC1的保护作用

目的探讨补肾活血汤对衰老耳蜗毛细胞株HEI-OC1自噬和凋亡的影响。方法应用D-半乳糖构建衰老HEI-OC1细胞的体外模型后,将细胞分为对照组、衰老组、含药血清低、中及高剂量组(5%、10%、20%),采用噻唑蓝(MTT)比色法检测耳蜗HEI-OC1细胞的增殖能力;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老状态;膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡的程度;Western印迹检测细胞中自噬和凋亡相关蛋白的表达水平。结果MTT、β-半乳糖苷酶染色、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和Western印迹结果显示,与对照组比较,衰老组HEI-OC1细胞增殖能力明显下降;细胞衰老状态明显增加,细胞凋亡率明显增加,Atg5、Atg12、Beclin1和Bcl-2蛋白表达水平明显下降,p62和Bax蛋白表达水平显著升高(均P<0.01)。与衰老组比较,补肾活血汤各组HEI-OC1细胞增殖能力明显上升;细胞凋亡率明显降低;Atg5、Atg12、Beclin1和Bcl-2蛋白表达水平显著增加(均P<0.05);p62和Bax蛋白表达水平显著下降(均P<0.05),且均呈现出剂量依赖性。结论补肾活血汤可通过促进自噬及抑制凋亡来延缓耳蜗毛细胞株HEI-OC1的衰老,且与其浓度相关。     

山茱萸多糖对D-半乳糖致衰老小鼠肾组织中Klotho基因表达的影响

目的研究山茱萸多糖对D-半乳糖致衰老小鼠肾组纵中Klotho基因表达变化的影响。方法昆明小鼠60只,随机分为青年对照组、衰老模型组、山茱萸多糖组,每组20只。采用D-半乳糖法制作衰老模型,以灌胃法给山茱萸多糖组小鼠灌服山茱萸多糖。采用分光光度法检测总抗氧化能力（T—AOC）和Mn—SOD活性水平,RT—PCR法检测Klotho和Mn—SOD基闪表达水平,Westernblot法检测Klotho蛋白表达最。结果与对照组比较,衰老组小鼠肾组织中Klotho基因、Mn—SOD活性和基斟表达均下降（P〈0．01）,总抗氧化能力（T—AOC）下降（P〈0．01）;与衰老模型组比较,山茱萸多糖组小鼠Klotho基困和蛋白表达明显升高（P〈0．01）、Mn-SOD基因表达和Mn-SOD活性明显增高（P〈0．01）,总抗氧化能力也显著提高（P〈0．01）。结论山茱萸多糖可能通过上调衰老小鼠肾组织中的Klotho表达和提高衰老小鼠抗氧化能力岍发挥抗衰老的作用。     

不同浓度山茱萸多糖对HDF细胞衰老的影响

目的 研究不同浓度山茱萸多糖对体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)的影响,探讨制备含山茱萸多糖家兔血清的最佳采血时间.方法　选择家兔为对象,制备含山茱萸多糖血清,DMEM培养基培养复制性衰老HDF细胞;采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,MTT法检测细胞活力.将HDF细胞分为4组,观察不同浓度含山茱萸多糖家兔血清培养基对衰老HDF细胞细胞活力的影响.结果 血清中山茱萸多糖浓度在给药1.5,2,4 h明显高于给药0.5、11 h(P<0.001),给药2,2.5,3,3.5,4 h高于0.5、11 h(P<0.01),而在给药48,72 h则明显降低(P<0.01).培养基中加入含山茱萸多糖兔血清(SCP)0.5%、1%和1.5%均能提高衰老HDF细胞活力(P<0.01),细胞衰老表型不明显,其中1%SCP组效果好于0.5%,1.5%组.而2%SCP组和 3%SCP组表现明显的细胞生长抑制.结论 制备含山茱萸多糖家兔血清最佳取血时间是在给药后1.5～2 h或4 h,山茱萸多糖抗HDF细胞衰老作用效果最好的是1%含山茱萸多糖兔血清组.