ATF6对骨肉瘤MCA205细胞免疫原性的调控作用及其机制的初步探索

目的：探讨活化转录因子 6（ATF6）对骨肉瘤细胞 MCA205 免疫原性的影响,初步解析其调控机制。方法：利用CRISPR-Cas9技术敲除MCA205细胞的Atf6基因,借助CCK-8实验、细胞能量代谢检测、流式细胞术、ATP检测试剂盒、干扰素刺激响应元件（ISRE）-荧光素酶报告细胞实验和qPCR法分别检测野生型（WT）和Atf6-/- MCA205细胞在PBS或衣霉素（Tm）处理后的活力、线粒体耗氧速率（OCR）和胞外酸化速率（ECAR）、磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜通透性、胞内钙离子动员、胞内外ATP浓度、IFN-a/b分泌和干扰素刺激基因（ISG）的表达水平。在免疫系统健全的小鼠皮下接种WT或Atf6-/- MCA205细胞,比较两者的成瘤速度、肿瘤组织基因转录图谱、局部抗肿瘤效应T细胞活化有无差异。将WT和Atf6-/- MCA205细胞分别接种于nu/nu小鼠背部两侧皮下,或将Atf6-/- MCA205细胞分别接种于免疫系统健全小鼠和Ifnar-/-小鼠皮下,记录肿瘤生长曲线。分别用Tm预处理的WT和Atf6-/- MCA205细胞对na?ve小鼠（未经免疫刺激的小鼠）进行初次免疫,使肿瘤抗原特异性T细胞发生初次活化（prime）,随后收集引流淋巴结细胞并进行体外再刺激（boost）,分析特异性T细胞再次活化有无差异。按照不同的效靶比,将NK细胞与染料标记的WT和Atf6-/- MCA205细胞共培养,流式细胞术检测细胞杀伤情况。结果：PBS或Tm处理后,WT和Atf6-/-骨肉瘤细胞活力和增殖、氧化磷酸化和糖酵解、离子霉素触发的胞内钙离子动员、胞内外ATP和IFN-a/b分泌均无显著差异。Tm处理后,Atf6-/-细胞死亡比例低于WT细胞（P<0.01）。在免疫系统健全的小鼠体内,Atf6-/-肿瘤的生长速度明显低于WT肿瘤（P<0.05）。然而,在缺乏T细胞的nu/nu小鼠体内,两种肿瘤生长速度的差异显著缩小。与免疫系统健全的小鼠相比,Ifnar-/-小鼠体内Atf6-/-肿瘤的生长速度略快（P<0.05）。Atf6-/-肿瘤内免疫应答相关基因的表达、效应T细胞的活化均显著高于WT肿瘤（P<0.05）。与WT MCA205细胞相比,Atf6-/- MCA205细胞与NK细胞共培养后死亡比例更高（P<0.05）。在Tm刺激后,Atf6-/- MCA205细胞比WT细胞表达更多的Irf3和Irf7,前者在prime-boost实验中可刺激T细胞分泌更多的IFN-g。结论：阻断ATF6信号通路能显著增强MCA205细胞的免疫原性,促进免疫监视,阻碍肿瘤进展。