结直肠癌肿瘤引流淋巴结T细胞的特征及其功能

目的：探讨结直肠癌（colorectal cancer,CRC）肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymph node,TDLN）中T细胞的免疫学 特性及其抗肿瘤作用。方法：收集2018年12月至2021年1月贵州医科大学附属医院收治的33例CRC患者的临床资料和淋巴 结标本。采用染料法示踪,配对采集CRC患者TDLN和非肿瘤引流淋巴结（non-TDLN,NTDLN）。用流式细胞术检测已制备成 单细胞悬液的TDLN和NTDLN中免疫细胞亚群和功能表型差异,酶联免疫斑点法比较 TDLN 和 NTDLN 中肿瘤反应性 T 细 胞比例,多色免疫荧光组织化学技术分析两种淋巴结中免疫细胞空间分布情况。体外扩增 TDLN-T 细胞,检测其 T 细 胞亚群和表型变化以及肿瘤免疫反应能力。结果：与NTDLN相比,TDLN中含有更高比例肿瘤反应性T细胞（ P<0.05）,调节 性T（Treg）细胞比例较高（P<0.01）,但单核样髓源性抑制细胞比例较低（P<0.05）,T细胞活化标志物ICOS、CD28和抑制标志物 PD-1、TIGIT比例均显著升高（P<0.05或P<0.01）。Treg细胞和滤泡性T细胞主要分布在淋巴结皮质区和生发中心。TDLN-T细 胞扩增后,以CD8+ T细胞为主（P<0.01）,ICOS、CD28 表达升高（P<0.05或P<0.01）,肿瘤反应性 T 细胞比例升高（P<0.01）。结论：CRC的TDLN中T细胞处于免疫激活状态,同时高表达免疫抑制标志物;体外培养可以增加TDLN-T细胞活化水平,并提 高抗肿瘤T细胞比例。     

红景天苷通过TLR4调控DC提高T细胞对肺癌3LL细胞的杀伤力

目的：探讨红景天苷（salidroside，SAL）对树突状细胞（dendritic cell，DC）表型及细胞毒性T细胞（cytotoxic T lympho‐cyte，CTL）抗肿瘤能力的影响。方法：选用Lewis肺癌细胞株3LL、野生型C57BL/6和TLR4-/-C57BL/6小鼠，获取小鼠骨髓来源的DC前体细胞，经过培养分化成未成熟DC，收获第6天的DC，经磁珠分选后获得纯度较高的CD11c+DC。将细胞分成PBS组、SAL组和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）组，培养48 h后用流式细胞术检测SAL体外对DC表面分子、吞噬功能、TLR4通路和对T细胞杀伤能力的影响。结果：与 PBS 组比较，SAL组DC的表面分子CD80、CD86、MHC Ⅱ表达水平显著升高（均 P<0.05）、吞噬功能显著下降（P<0.05）、TLR4 表达水平显著升高（P<0.01）；与野生型组比较，TLR4-/-组DC经SAL或LPS处理后，其表面分子CD80、CD86、MHC Ⅱ的表达水平显著降低（均P<0.05）；与PBS组比较，SAL组刺激活化的CTL对肺癌3LL细胞的杀伤效应显著升高（P<0.05）。结论：SAL可以通过调控TLR4诱导DC成熟，从而提高T细胞的杀伤能力     

捕获肿瘤抗原的树突状细胞治疗小鼠膀胱肿瘤

目的：研究捕获肿瘤抗原的树突状细胞（dendritic cells,DC)治疗膀胱肿瘤的可行性。方法：分离小鼠脏树突状细胞,外体经粒－巨细胞集落刺激因子（GM－CSF）活化和放射线来活的肿瘤细胞刺激后（D组）,治疗膀胱肿瘤移植模型,并设立空白对照组（A）,单纯GM－CSF活化的树突状细胞组（B）及灭活肿瘤细胞组（C）。结果：D组特异性T淋巴细胞活性、IL－4及IFN－γ水平明显高于其它组（P＜0．01）;所有小鼠长期无瘤存活（＞100天）而其它组小鼠存活期小于30天（P＜0．001）。结论：捕获肿瘤抗原的树突状细胞治疗膀胱肿瘤具有一定的临床应用前景。     

PD-1单抗联合顺铂或吉西他滨化疗对KRAS突变非小细胞肺癌A549 细胞移植瘤小鼠模型的治疗作用

目的：探讨程序性死亡受体-1(PD-1)单抗联合顺铂或吉西他滨在KRAS基因突变非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞移植瘤小鼠模型治疗中的作用。方法：构建免疫系统-肿瘤双人源化A549细胞小鼠移植瘤模型,将60只小鼠按随机数字表法分成6组（10只/组）,分别为对照组（200μL/kg PBS）、PD-1单抗组（20 mg/kg PD-1单抗）、顺铂组（3 mg/kg顺铂）、PD-1单抗+顺铂组（20 mg/kg PD-1单抗+3 mg/kg顺铂）、吉西他滨组（30 mg/kg吉西他滨）和PD-1单抗+吉西他滨组（20 mg/kg PD-1单抗+30 mg/kg吉西他滨）。TUNEL和DAPI双染色法检测移植瘤组织中细胞凋亡水平,测量移植瘤体积和质量并计算肿瘤生长抑制率,免疫组化法检测移植瘤微血管密度（MVD）。结果：成功构建免疫系统-肿瘤双人源化NSCLC A549细胞小鼠移植瘤模型,PD-1单抗+顺铂组移植瘤的细胞凋亡率、肿瘤生长抑制率均最高,移植瘤体积、质量和MVD均最小,与其他5组小鼠比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：顺铂与PD-1单抗具有协同活性,而吉西他...     

荷乳腺癌小鼠髓源抑制性细胞对B细胞功能的影响

目的：探讨荷乳腺癌小鼠髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cell,MDSC）对B细胞功能的影响。方法：构建BABL/c 小鼠4T1 乳腺癌模型,磁珠分选出荷瘤小鼠脾脏的MDSC与正常小鼠脾脏的B细胞,将MDSC与B细胞共孵育后流式细胞术检测MDSC对B细胞表面分子PD-1、PD-L1、CTLA-4、CCR6、CD62L 和MHCⅡ表达的影响,ELISA 法检测B细胞分泌的IgA、IgM和IgG的变化;BrdU试剂盒检测B细胞增殖情况;Annexin Ⅴ/PI 凋亡试剂盒检测B细胞凋亡。磁珠分选出共孵育体系中的B细胞,将其与T细胞共孵育,BrdU 试剂盒检测T细胞增殖情况,Annexin Ⅴ/PI 凋亡试剂盒检测T细胞凋亡。结果：与B细胞对照组相比,B+MDSC组中B细胞表面PD-L1 表达升高（P<0.01）,PD-1、CTLA-4、CCR6、CD62L 和MHCⅡ的表达均降低(均P<0.01);B细胞分泌的IgA、IgM 和IgG 明显升高（均P<0.01）,B细胞增殖增高（P<0.01）、凋亡降低（P<0.01）。与T细胞对照组相比,B+MDSC (1∶5）+T组的T细胞增殖明显降低（P<0.01）,T细胞凋亡无明显变化。结论：荷乳腺癌小鼠MDSC促进B细胞增殖和抑制B细胞凋亡,并且MDSC诱导的B细胞可以抑制T细胞的增殖。     

中央记忆型T细胞与肿瘤免疫治疗的相关性研究进展

记忆T细胞（memory T cell,Tm）作为人体免疫系统中的一个组成部分，在免疫应答中发挥着至关重要的作用。中央记忆型T细胞（central memory T cell,Tcm）是幼稚T细胞经过抗原激活后，产生的具有长期记忆性的、并能够归巢到淋巴结接受抗原再刺激的T细胞。肿瘤免疫治疗的抗肿瘤作用及不良反应的发生与T细胞功能密切相关，Tcm不仅是介导免疫应答的防线，其作为疗效预测生物标记物的研究也取得了相当大的进展。目前肠道菌群对肿瘤免疫治疗的影响备受关注，肠道菌群及其代谢产物通过影响肿瘤微环境调控疗效，其在免疫细胞层面的机制值得探究。本文对Tcm在组织中的分化、表面标记，在肿瘤免疫治疗中的作用及其与肠道菌群的联系等方面的研究进展进行综述。     

妇科肿瘤免疫治疗的新靶点

虽然作用于程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡配体 1（PD-1/PD-L）和细胞毒性 T淋巴细胞抗原4（CT- LA4）的抗体已成功应用于晚期实体瘤的治疗，但其疗效仍不够高。需寻找新的免疫靶点以便为难治性肿瘤患者寻求替代治疗。根据受体与配体结合后发挥的作用，可将免疫靶点分为共刺激分子和共抑制分子，共抑制分子包括∶T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（TM-3）、含免疫球蛋白及 ITM 结构域的T 细胞免疫受体（TGIT）、淋巴细胞活化基因3（LAG-3）、T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域（VISTA）以及 B7家族的 B7-H3 和 B7-H4;共刺激分子包括 CD27、OX40、4-1BB、CD40，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）和诱导共刺激因子（ICOS）等。本文就新兴的免疫靶点在妇科恶性肿瘤的临床前和临床研究进展作一简要阐述。     

T细胞的扩增及其信号转导分子ZAP-70的检测

目的检测γδT细胞信号转导分子ζ链相关蛋白-70（ζ-chainassociated protein70,ZAP．70）。方法分离获取健康人PBMC,用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb．Ag）刺激PBMC,通过流式细胞仪检测总T细胞和丫6T细胞CD69分子的动态表达;Mtb-Ag活化俩T细胞增殖培养,10d后收集细胞,用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞;westernblot方法检测γδT细胞内的ZAP．70分子。结果总T细胞和γδT细胞均在活化刺激24h时表达CD69分子达高峰,但总T细胞仅为16％,γδT细胞可达75．2％;新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4．9％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为69．2％,免疫磁珠阳性分选后达99-3％;检测到Y6T细胞内的ZAP-70分子。结论Mtb-Ag可特异性激活俩T细胞,用Mtb-Ag刺激γδT细胞活化增殖培养,可获得大量的γδT细胞;成功地检测到细胞内ZAP-70分子,这为Y6T细胞内其它分子的检测分析奠定方法学基础,也为进一步检测γδT细胞活化信号转导过程中ZAP-70分子的激活及作用奠定基础。     

未活化巨噬细胞对杂交瘤/瘤细胞作用的研究

 用正常Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液（MφSN）培养杂交瘤细胞，瘤细胞，正常细胞，用台盼兰染色法。（³H）-TdR掺入法，ELISA法观察Mφ-SN中能够刺激杂交瘤/瘤细胞生长的活性物质，对该物质的生物活性进行探讨。结果表明：Mφ-SN中含有刺激杂交瘤/瘤细胞生长的活性物质，该物质不能使ConA激活的T细胞增殖，也不能刺激C₃H，/HeJ小鼠胸腺细胞增殖，其生物活性不同于白细胞介素-1（IL-1），IL6。     

淋巴细胞减少期联合免疫重建和瘤苗免疫增强抗肿瘤免疫的机制

目的阐明向免疫重建的淋巴细胞减少小鼠（reconstituted lymphopeniemice,RLM）进行瘤苗免疫增强抗肿瘤免疫反应的机制。方法分别以放疗和环磷酰胺处理C57BL／6小鼠,建立淋巴细胞减少模型,并各设正常一非免疫组、RLM-非免疫组、正常-免疫组和RLM-免疫组等4个实验组。在免疫重建的24h内,分别用灭活黑色素瘤细胞F10（放疗实验部分）和GM—CSF修饰的活黑色素瘤细胞D5-G6（化疗实验部分）免疫,8—10d后采集肿瘤疫苗部位引流淋巴结（tumor vaccine draining lymphnode,TVDLN）,以FACS分析细胞表型。磁珠纯化的T细胞分别经anti—CD3及anti—TCRβ刺激后,分别以[^3H]一TdR掺入法和FACS检测T细胞的增殖能力和CD69的表达情况,以此反映T细胞的激活阈值。结果RLM-免疫组TVDLN中,DC细胞和活化T细胞的频数显著增高。新鲜T细胞的体外增殖能力显著增强,激活阈值明显降低。结论放、化疗引起的淋巴细胞减少可诱导T细胞增殖活化,激活阈值降低,有助于瘤苗免疫打破机体对肿瘤的免疫耐受,增强抗肿瘤免疫反应。     

Minichromosome maintenance protein 6, a proliferation marker superior to Ki-67 and independent predictor of survival in patients with mantle cell lymphoma

Minichromosome maintenance protein 6 (MCM6) is one of six proteins of the MCM family which are involved in the initiation of DNA replication and thus represent a marker of proliferating cells. Since the level of cell proliferation is the most valuable predictor of survival in mantle cell lymphoma (MCL), we investigated lymph node biopsy specimens from 70 patients immunohistochemically with a monoclonal antibody against MCM6. The percentage of MCM6 expressing lymphoma cells ranged from 12.0 to 95.6%, with a mean of 61.0%, and was significantly higher than the percentage of Ki-67-positive cells (P<0.0001). Surprisingly, the ratio of MCM6-positive cells to Ki-67-positive cells was higher than in normal stimulated peripheral blood mononuclear cells, indicating a cell early G1-phase arrest in MCL. A high MCM6 expression level of more than 75% positive cells was associated with a significantly shorter overall survival time (16 months) compared to MCL with a low MCM6 expression level of less than 25% (no median reached, P<0.0001). Multivariate analysis revealed MCM6 to be an independent predictor of survival that is superior to the international prognostic factor and the Ki-67 index. Therefore, aside from gene expression profiling, immunohistochemical detection of MCM6 seems to be the most promising marker for predicting the outcome in MCL.     

CHARACTERIZATION OF A HUMAN HERPES VIRUS－6（HHV－6） AND EPSTEIN－BARR VIRUS（EBV） ASSOCIATED LEUKEMIC CELL LINE，J6－1

ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮＯＦＡＨＵＭＡＮＨＥＲＰＥＳＶＩＲＵＳ－６（ＨＨＶ－６）ＡＮＤＥＰＳＴＥＩＮ－ＢＡＲＲＶＩＲＵＳ（ＥＢＶ）ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤＬＥＵＫＥＭＩＣＣＥＬＬＬＩＮＥ，Ｊ６－１ＷｕＫｅｆｕ吴克复；ＪａｎｏｓＬｕｋａ；Ｓｈａｎｔ...     

食管鳞癌组织PTK6表达临床意义研究

目的探讨酪氨酸激酶-6(protein tyrosine kinase 6,PTK6)在食管鳞癌组织中的表达,及其与食管鳞癌发生发展及临床病理因素的相关性。方法采用免疫组织化学方法,检测2003-01-01-2005-12-01中山大学肿瘤防治中心胸外科切除的67例食管鳞癌及正常食管黏膜上皮组织中PTK6表达水平;在蛋白质和RNA水平检测7对手术切除的食管鳞癌及其癌旁组织标本中PTK6的RNA与蛋白表达情况。结果 PTK6在癌组织中的表达明显弱于癌旁正常黏膜组织,50.7%(34/67)的食管鳞癌组织中检测到PTK6蛋白高表达,73.1%(49/67)正常食管黏膜上皮组织中检测到PTK6蛋白高表达,两者差异有统计学意义,χ2=7.123,P=0.008。食管癌组织中PTK6表达水平与肿瘤浸润深度(χ2=0.647,P=0.03)和病理分级(χ2=0.577,P<0.001)密切相关,PTK6低表达组5年总生存率为31.9%,显著低于PTK6高表达组的77.3%,差异有统计学意义,P=0.021。RT-PCR及蛋白质印迹结果证实,无论是在基因水平还是蛋白水平,PTK6在食管鳞癌组织中均呈低表达。结论 PTK6在食管鳞癌的发生发展中起着重要作用,可能作为食管癌判断预后的独立预测因素。     

CMTM6 和PD-L1 蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及其与患者临床病理特征的相关性

[摘要] 目的：探讨趋化素样因子超家族6（CMTM6）、程序性死亡受体-配体1（PD-L1）在脑胶质瘤组织中的表达及其与患者临床病理特征的相关性。方法：选用2012 年1 月至2015 年12 月于郑州大学第五附属医院神经外科手术切除的86 例脑胶质瘤标本及30 例头颅外伤去骨瓣减压患者的脑组织标本（对照组）,用免疫组化法、WB法检测脑胶质瘤组织中CMTM6 和PD-L1 蛋白的分布与表达,用两独立样本t 检验分析CMTM6 与PD-L1 的表达差异,用单因素χ2检验分析CMTM6 和PD-L1 表达与患者临床病理特征之间的关系。结果：胶质瘤组织中CMTM6 的表达水平明显高于对照组织（P<0.01）, 高病理级别（WHO Ⅲ-Ⅳ）胶质瘤组织中CMTM6 和PD-L1 的表达水平均明显高于低病理级别（WHO Ⅰ-Ⅱ）胶质瘤组织（均P<0.01）。CMTM6 表达与患者脑胶质瘤病理级别、头晕病史、癫痫发作、PD-L1 表达有关（均P<0.05）,PD-L1 表达与脑胶质瘤病理级别、癫痫发作、CMTM6 表达有关（均P<0.05）。结论：CMTM6 和PD-L1在脑胶质瘤组织中均高表达且两者间有一定相关性,有望用于研究脑胶质瘤信号通路。     

宫颈癌组织中MCM4、CDC6的表达及其与HPV16/18感染的相关性

摘 要 目的: 研究微小染色体维持蛋白4(minichromosome maintenance proteins 4,MCM4)、细胞分裂周期蛋白(cell division cycle 6,CDC6)在宫颈癌组织中的表达及其与人乳头状瘤病毒16/18型(human papilloma virus 16/18 type,HPV16/18)感染的相关性及其临床意义。方法：收集2006-2007年间山西大同市第五人民医院病理科经病理证实的50例宫颈癌、20例宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia, CIN）Ⅰ、20例CINⅡ-Ⅲ、20例正常宫颈组织石蜡标本，以免疫组织化学法检测这些组织标本中MCM4、CDC6的表达，同时采用PCR技术检测HPV16/18的感染情况。结果：（1）在宫颈癌组织中MCM4、CDC6表达的阳性率显著高于CIN和正常宫颈组织（均P<0.05），且MCM4、CDC6阳性表达率与宫颈癌病理分级和淋巴转移相关（均P<0.05），而与年龄分组、临床分期无关（均P>0.05）。（2）HPV16/18 感染在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织中的阳性率依次升高（P<0.05），但与宫颈癌患者年龄、临床分期、病理分级、淋巴转移无关（均P>0.05）。（3）宫颈癌组织中MCM4和CDC6的表达呈正相关（r= 0.390;P<0.05）；MCM4和CDC6表达均与HPV16/18感染相关（r=0.634, P<0.05; r=0.386, P<0.05）。结论：宫颈癌及CIN组织中MCM4、CDC6表达的改变与HPV16/18感染密切相关，共同影响CIN的发展及宫颈癌的发生与发展。     

A mutual activation loop between breast cancer cells and myeloid-derived suppressor cells facilitates spontaneous metastasis through IL-6 trans-signaling in a murine model

Introduction

Tumor cell interactions with the microenvironment, especially those of bone-marrow-derived myeloid cells, are important in various aspects of tumor metastasis. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) have been suggested to constitute tumor-favoring microenvironments. In this study, we elucidated a novel mechanism by which the MDSCs can mediate spontaneous distant metastasis of breast cancer cells.

Methods

Murine breast cancer cells, 4T1 and EMT6, were orthotopically grafted into the mammary fat pads of syngeneic BALB/c mice. CD11b⁺Gr-1⁺ MDSCs in the spleen, liver, lung and primary tumor mass were analyzed. To evaluate the role of MDSCs in the distant metastasis, MDSCs were depleted or reconstituted in tumor-bearing mice. To evaluate whether MDSCs in the metastasizing tumor microenvironment affect breast cancer cell behavior, MDSCs and cancer cells were co-cultivated. To investigate the role of MDSCs in in vivo metastasis, we blocked the interactions between MDSCs and cancer cells.

Results

Using a murine breast cancer cell model, we showed that murine breast cancer cells with high IL-6 expression recruited more MDSCs and that the metastasizing capacity of cancer cells paralleled MDSC recruitment in tumor-bearing mice. Metastasizing, but not non-metastasizing, tumor-derived factors induced MDSCs to increase IL-6 production and full activation of recruited MDSCs occurred in the primary tumor site and metastatic organ in the vicinity of metastasizing cancer cells, but not in lymphoid organs. In addition, tumor-expanded MDSCs expressed Adam-family proteases, which facilitated shedding of IL-6 receptor, thereby contributing to breast cancer cell invasiveness and distant metastasis through IL-6 trans-signaling. The critical role of IL-6 trans-signaling was confirmed in both the afferent and efferent pathways of metastasis.

Conclusion

In this study, we showed that metastasizing cancer cells induced higher MDSCs infiltration and prompted them to secret exaggerated IL-6 as well as soluble IL-6Rα, which, in turn, triggered a persistent increase of pSTAT3 in tumor cells. This potential tumor-MDSC axis involving IL-6 trans-signaling directly affected breast cancer cell aggressiveness, leading to spontaneous metastasis.     

CDK6及E2F-1参与细胞周期调控pRb通路的研究进展

目前肿瘤的本质被认为是一种细胞周期病,细胞周期的调控是一种受多条件限制、由多因素参与的复杂并且精细的过程,其经典途径包括pRb途径及p53途径,其中任何一个环节出现异常,均可能导致肿瘤的发生。细胞周蛋白依赖性激酶6(CDK6)、核转录调节因子E2F-1均参与细胞周期调控的RB通路,在G1期向S期转换过程中起到非常关键的作用。现有研究已证实,在人体的很多肿瘤中CDK6、E2F-1表达均呈现异常,其与肿瘤的发生发展有密切联系。因此,进一步了解二者在细胞周期调控中的作用及其在不同类别肿瘤中的表达异常对了解肿瘤的发生发展有重大意义。     

白介素6在雌激素促进小鼠肺腺癌进展中的作用及其机制

目的 探讨白介素6（interleukin 6, IL-6）在雌激素（estrogen, E2）促进小鼠肺腺癌进展中的作用及其可能的机制。方法 采用乌拉坦诱导雌性昆明小鼠建立肺腺癌模型,进行如下分组处理（每组9只）：空白对照组、E2组、雌激素抑制剂（E2 inhibitor, E2I）组、E2+E2I组、IL-6组、E2+IL-6组。小鼠饲养16周后处死检测小鼠体重变化、成瘤情况、肿瘤分级、肺脏器指数等指标,酶联免疫法（ELISA）检测对照组血清标本中E2/IL-6的含量,实时荧光定量PCR（Real-Time PCR, RT-PCR）检测对照组肿瘤标本中ERβ/IL-6的mRNA表达水平,采用免疫印迹法检测各组ERβ、Akt、MAPK,p-ERβ、p-Akt、p-MAPK表达水平。结果 肺部出现结节的昆明小鼠占小鼠总数的比例（即称为成瘤率）为87.04%（47/54）,小鼠肺部结节做病理切片后证实为肺腺癌的小鼠数目占小鼠总数的比例（即成癌率）为70.37%（38/54）,肺结节数、肿瘤指数、肺脏器指数等统计指标在E2组显著高于E2+E2I组、E2I组、E2+IL-6组、IL-6组及空白对照组（P均<0.05）;对照组小鼠血清中E2与IL-6呈高度相关性（P均<0.05）,各组小鼠肺癌组织中Akt、MAPK、ERβ、p-AKt、p-MAPK、p-ERβ的表达水平及ERβ的mRNA表达水平与肿瘤统计指标表达的趋势相一致（P均<0.05）。结论 在E2促进小鼠肺腺癌进展过程中IL-6具有下调ERβ信号通路作用,提示IL-6可能抑制E2促进肺腺癌进展。