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1.
肺炎链球菌不同菌株自溶酶基因的克隆、序列分析及重组表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的克隆肺炎链球菌自溶酶(LytA)的基因序列,并进行重组表达。方法分别提取不同临床分离株的基因组DNA,根据已知肺炎链球菌野生R6株LytA基因序列设计引物,进行PCR扩增,将获得的目的基因片段克隆人原核表达质粒,然后测序;利用生物信息学方法,对不同临床分离株LytA基因序列进行比较分析,同时进行LytA基因的重组表达。结果从不同临床分离株的基因组中均扩增出完整的LytA基因片段,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-LytA。比较不同临床分离株LytA基因的DNA序列及推测的氨基酸序列,发现各株LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异。通过异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导,LytA基因在大肠埃希菌JM109中得到高效表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示pGEX-4T-1-LytA融合蛋白相对分子质量约62000,与理论预测一致。结论序列分析发现各分离株的LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异,但同源性极高,推测LytA基因序列保守,可用于疫苗研发。 相似文献
2.
恶性疟原虫疫苗研究Ⅱ.一种新的化学拼接法重组多价保护性抗原的基因 总被引:1,自引:2,他引:1
将恶性疟原虫保护性抗原环子孢子蛋白(CSP)、环状体感染红细胞表面抗原(RESA)、裂殖子表面抗原1和2(MSA1和MSA2)4种抗原中具有T和/或B细胞表位的6个基因片段,按照我们设计的方案排成一条线性序列,经在计算机上分析比较后,分成长短不一的8个基因片段(F1~F8),其中F1、F3、F5和F7为正链片段,F2、F4、F6和F8为负链片段。每相邻两个片段间预设15个互补碱基搭头。在DNA合成仪上分别合成这8个片段后,把F2~F76个片段分别磷酰化,按等摩尔浓度混合。经30℃退火,使8个片段连接起来,然后按基因体外扩增的原理,填补互补碱基以外的缺口,重组成新的多价基因。我们把这种化学拼接法取名为“缺口填补法(Filling-qapMethod)”,经克隆和测序验证,表明这种方法具有效果好、经济、简便等优点。 相似文献
3.
目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。 相似文献
4.
目的 扩增恶性疟原虫FCC1/HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1/HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21/DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8%,但与人的4型HK的同源性只有23.2%~26.6%。 结论 获得恶性疟原虫FCC1/HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。 相似文献
5.
目的构建恶性疟原虫CTP
基因的真核表达载体,以便进一步研究其功能. 方法根据Genbank
已发表恶性疟原虫CTP基因序列(序列号为X084041),自行设计并合成了一对引物,通过聚合酶链反应扩增出CTP基因,经HindⅢ和BamHⅠ消化后定向克隆入测序载体pUC19,构建重组质粒pUC19-CTP.经双酶切、PCR扩增和序列测定,证实插入片段与已知CTP编码序列完全相同.用HindⅢ和BamHⅠ消化pUC19-CTP,将双酶切下的CTP编码基因片段定向亚克隆入真核表达载体pcDNA3.
结果经双酶切和PCR扩增鉴定证实CTP基因正向插入真核表达载体pcDNA3中.
结论真核表达质粒pcDNA3-CTP构建成功. 相似文献
6.
目的 表达亚洲带绦虫(Taenia asiatica,Ta)成虫烯醇化酶(enolase,ENO)基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。 方法 通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a(+),在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。 结果 PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a(+)-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量(Mr)为47 000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37 mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。 结论 纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。 相似文献
7.
目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。 相似文献
8.
目的 应用生物信息学分析软件预测日本血吸虫乳酸脱氢酶(SjLDH)氨基酸序列的结构与功能。 方法 应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及Vector NTI、PCgene等软件包分析SjLDH与其他物种的同源序列,进行多序列同源比对,分析相同的保守位点及催化活性位点,构建分子进化树;预测二级结构、拓扑结构;同源模建预测三级结构;预测主要抗原表位等。 结果 SjLDH与其他物种的同源序列含相同的保守位点及催化活性位点,与华支睾吸虫LDH(CsLDH)同源性最高为75%,与阴道毛滴虫LDH(TvLDH)同源性最低为17%,与人LDH(HsLDH-A,-B,-C)的同源性为58%~60%; SjLDH与果蝇(DmLDH)的进化距离较秀丽隐杆线虫(CeLDH)为近,3种人LDH中与HsLDH-B、-C的进化距离较HsLDH-A为近;该蛋白具有3个跨膜区域,3个高亲水性区域,主要的线性表位98aa~106aa位于膜外,与原虫LDH相同区域差异显著,而与其他LDH有1~3个氨基酸的差异,关键催化位点之一及底物丙酮酸结合区域位于该区域,蛋白质同源模建分析表明该区域位于蛋白表面形成环状结构,3个关键催化位点位于该区域或在其附近。 结论 生物信息学预测结果提示LDH是研究物种分子进化理想的分子;SjLDH可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子。 相似文献
9.
目的 筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶 (csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。 方法 对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序 ,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifsan、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析。根据PGEX 4T 1和 pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAHcDNA编码序列设计引物 ,进行PCR扩增 ,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX 4T 1和真核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX 4T 1 csLysoPLAH、pcDNA3 csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。 结果 发现csLysoPLAH基因 ,完整阅读框含 70 8个碱基 ,编码 2 3 5个氨基酸 ,理论分子质量为 2 5 .2 62 8ku ,理论pI为6.0 3。序列分析表明 ,csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,csLysoPLAH具有磷脂酶 /羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域 ,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽 (即GXSXG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。 结论 发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因 ,并成功构建原核和真核重组表达质粒。 相似文献
10.
弓形虫表面抗原SAG3基因片段克隆及序列测定 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 克隆弓形虫ZS2及RH株SAG3表面抗原基因片段,并进行序列分析。方法 设计合成引物,从弓形虫ZS2、RH及ZS1株基因组DNA中分别特异扩增出编码SAG3抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切后,克隆到原核表达质检pGEX-47-2中,转化入大肠杆菌JMl09,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EooRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果 从弓形虫ZS2、RH和ZS1株DNA中扩增出1176bp的SAG3基因,构建重组质检pGEX-47-2-SAG3(pGEX—SAG3),酶切产物的大小分别与预期相符。结论 成功地对弓形虫ZS2、RH和ZS1株SAG3基因进行体外扩增及构建原核表达重组质检pGEX-SAG3,并经酶切及序列分析所验证,为弓形虫SAG3表面抗原的表达、体外诊断研究做好准备。 相似文献