华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析

目的筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因，并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶(csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3上，为进一步研究其功能奠定基础。方法对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序，在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析，识别华支睾吸虫新基因，并应用Motifsan、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行结构域分析。根据PGEX-4T-1和pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAH cDNA编码序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX-4T-1和真核表达载体pcDNA3上。构建的PGEX-4T-1-csLysoPLAH、pcDNA3-csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。结果发现csLysoPLAH基因，完整阅读框含708个碱基，编码235个氨基酸，理论分子质量为25．2628ku，理论pI为6．03。序列分析表明，csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性，csLysoPLAH具有磷脂酶／羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域，并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽(即GXSXG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。结论发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因，并成功构建原核和真核重组表达质粒。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的　通过筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库,寻找、识别新基因,并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX 4T 1中,表达出融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础。　方法　用文库通用引物对华支睾吸虫 cDNA 质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒进行测序,测序结果在NCBI 和ExPasy 网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据 pGEX 4T 1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA 编码序列设计引物,进行PCR 扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1 上。构建的重组表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定,并对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS PAGE电泳鉴定。　结果　发现CsGAPDH基因,完整阅读框含1 017 个碱基对,编码339 个氨基酸,理论分子质量单位为37.024 09 ku ,理论pI为6.66 。序列分析显示,CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78%,具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS PAGE电泳显示表达产物在63 ku处有1条特异性条带。　结论　发现华支睾吸虫 GAPDH基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。     

华支睾吸虫表膜相关蛋白基因的扩增、序列分析和克隆

目的识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫表膜相关蛋白(tegumental protein ofClonorchis sinensis,CsTP)的cDNA序列克隆到原核载体中,为进一步的研究奠定基础。方法对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,用在线生物信息学工具进行序列分析,识别CsTP基因,并对其进行同源性、物理性质及结构分析。设计引物,从华支睾cD-NA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,并构建原核重组质粒,相同引物从华支睾吸虫基因组中扩增出CsTP的DNA序列。结果发现CsTP基因,其cDNA完整阅读框含555个碱基,编码184个氨基酸,理论分子量为20.7kDa;其DNA序列含1393个碱基,含有3个外显子、2个内含子。序列分析表明,CsTP蛋白与其它物种的表皮蛋白或膜相关蛋白有一定的同源性。所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-CsTP经PCR、双酶切及测序证实与目的基因相符。结论发现华支睾吸虫表膜相关蛋白基因,成功构建其重组原核表达质粒为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库，寻找、识别新基因，并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中，表达出融合蛋白，为进一步研究其功能奠定基础。方法用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增，对产物为500bp以上的质粒进行测序，测序结果在NCBI和ExPasy，网站上进行序列分析，识别华支睾吸虫新基因，并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据pGEX-4T-1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA编码序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体pGEx-4T-1上。构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定，并对鉴定过的重组体进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定。结果 发现CsGAPDH基因，完整阅读框含1017个碱基对，编码339个氨基酸，理论分子质量单位为37．02409ku，理论pI为6．66。序列分析显示，CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78％，具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS-PAGE电泳显示表达产物在63ku处有1条特异性条带。结论 发现华支睾吸虫GAPDH基因，成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达

目的　构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因重组质粒 ,分析其编码序列 ,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定。方法　根据RPEF基因已知序列设计一对引物 ,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段 ;将目的基因PCR产物和空质粒 pGEX 4T 1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切 ,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL2 1。将构建的重组质粒pGEX 4T 1 RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL2 1中诱导表达 ,SDS PAGE电泳和Western blot方法鉴定其原核表达效果。结果　成功构建出RPEF基因原核重组质粒 pGEX 4T 1 RPEF。SDS PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL2 1系统中得以高效表达 ,其融合蛋白分子量大约 4 5kD ,与理论值相符。Western blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别 ,融合蛋白具有GST免疫反应性。结论　筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因 ,并成功构建原核表达载体及在E .coliBL2 1系统中高效表达。     

华支睾吸虫磷脂酶A2基因生物学特性的初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫磷脂酶A2（CsPLA2）基因进行生克隆、原核表达,确定该蛋白是否为成虫分泌/排泄蛋白（excretory-secretory protein,ESP）。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出CsPLA2样基因,分析该基因表达蛋白的生物学功能特征;将CsPLA2克隆入原核表达质粒pET28a（＋）,并在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,蛋白表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;应用Western blot确定CsPLA2是否为ESP;应用免疫荧光方法观察CsPLA2在成虫的组织定位。结果该基因编码307个氨基酸,含有信号肽序列,具有PLA2功能域和活化位点,与谷蛀虫同源蛋白相比,一致性为45%,相似性为52%。PCR、双酶切及DNA测序结果表明pET28a-CsPLA2重组质粒构建成功,SDS-PAGE显示目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中高效表达,表达产物为包涵体。Western blot结果表明CsPLA2是华支睾吸虫的ESP组分之一。虫体免疫组织化学定位显示CsPLA2定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处。结论新发现一个CsPLA2基因,其表达的蛋白定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处,为华支睾吸虫成虫ESP组分之一。该基因可在原核表达系统中高效表达。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶两种表达方式的比较

目的 比较原核和真核2种表达系统重组表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶方法的优劣和目的产物的血清免疫学检测效果。方法 根据已知的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列分别设计引物扩增目的基因, 与相应的表达载体相连分别构建原核表达质粒pET28a?CP和真核表达质粒pPIC9K?CP, 双酶切及测序鉴定后, 将正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌（E. coli） BL21 （DE3） 和毕赤酵母GS115中诱导表达、 纯化; 将获得的纯化蛋白采用ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清和正常人血清, 比较诊断效果。结果 原核表达系统表达的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶以包涵体形式存在, 表达量为6.84 mg/L; 真核表达系统表达量达到65.00 mg/L, 且为可溶性蛋白; 两者检测华支睾吸虫病的敏感性分别为95.00%（57/60） 和 93.30% （56/60）, 特异性分别为91.67% （77/84） 和94.10% （79/84）, 差异均无统计学意义 （P均 > 0.05）。结论 真核表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶较原核表达系统具有更高的应用价值。     

华支睾吸虫一个谷胱甘肽转移酶新基因的克隆与表达

目的 克隆华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)的一个新基因,并在大肠杆菌中表达。方法 用PCR方法从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库中扩增新基因CsGST1,对DNA及其推导的氨基酸进行序列分析。将CsGST1克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库扩增出642 bp的CsGSTl,序列分析显示它所编码的氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST的同源性最高(88％),并具有GST N-末端和C-末端的保守功能域。构建了重组质粒pET-30a(+)-CsGST1,SDS-PAGE显示CsGST1在大肠杆菌中得到了高效表达,pET-30a(+)-CsGST1的蛋白条带的分子量约为30 kDa。结论成功构建了CsGST1的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

阿苯达唑和甲苯达唑对蛔虫和钩虫作用的超微结构观察

在体外美洲钩虫成虫接触药物后活动性明显下降，体表皱缩，随着作用时间延长，蠕动缓慢，咽收缩无力并且不规律，体态膨胀不均匀，48小时内虫体趋于不动。药物对体内蛔虫和体外钩虫作用的超微结构显示：微绒毛变性且部分消失；肠细胞分泌颗粒积聚并融合，出现自噬空泡，糖原减少，线粒体变性。蛔虫卵细胞间出现溶酶体，子宫细胞内质网疏松，分泌颗粒融合，糖原缺乏；精细胞充满致密小体，线粒体广泛变性。未见钩虫生殖细胞超微结构明显变化。     

Graves病治疗前及治疗中血清游离钙与血,尿钙磷代谢异常

46例Graves病患者治疗前血清游离钙(Ca~( ))、磷(P)、碱性磷酸酶(AKP)及24小时尿钙(Ca)、P、羟脯氨酸(Hyp)排量水平都显著高于正常对照组。经治疗2—3个月甲亢病情控制后,血Ca~( )、P及24小时尿Ca、P亦随之恢复正常,但血AKP与24小时尿Hyp仍高于对照组。高钙血症比率在血Ca、校正钙与Ca~( )测定中分别为11.2％、16.3％与30.0％。前臂骨密度呈现骨量减少和腰椎相示骨质疏松者分别为29.0％和13.3％。本文对Graves病患者的钙、磷和骨代谢改变及其发生作了初步讨论。