人乳头瘤病毒31型L1病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达及其免疫原性初步评价

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLP),并初步评价其免疫原性。方法构建HPV31 L1四拷贝重组表达质粒,电转化毕赤酵母KM71,甲醇诱导表达蛋白。将重组菌经30 L发酵罐发酵,产物分离纯化,用纯化样品免疫小鼠,采用半数有效剂量(median effective dose,ED50)初步评价表达产物的免疫原性。结果经双酶切鉴定,四拷贝重组表达质粒构建正确。表达产物可与小鼠抗HPV L1单抗发生特异性结合。纯化产物在透射电镜下为直径60 nm的VLP结构,相对分子质量约55 000,纯度达95%以上。小鼠体内效价ED50值为0. 018μg。结论成功在毕赤酵母中表达了HPV31型L1 VLP,其在小鼠体内具有良好的免疫原性。     

重组人乳头瘤病毒33型L1病毒样颗粒的表达、纯化及免疫原性评价

目的利用毕赤酵母表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)33型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),评价其在小鼠体内的免疫原性。方法构建HPV33 L1表达质粒,电转化毕赤酵母,筛选高表达菌株,15 L发酵罐发酵,离子交换和凝胶体积排阻层析分离纯化HPV33 L1 VLPs,纯化后样品免疫小鼠,采用假病毒中和试验检测小鼠免疫后血清中和抗体滴度。结果质粒HPV33 L1-pPIC3. 5K经双酶切及测序鉴定证明构建成功;毕赤酵母表达产物经Western blot分析,可见相对分子质量约56 000的目的条带;透射电镜下可见直径约60 nm的病毒样颗粒;纯化后的HPV33 L1 VLPs纯度可达95%以上;0. 4和0. 04μg HPV33 L1 VLPs免疫后小鼠血清中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为3 200和566,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论利用毕赤酵母成功表达了HPV33 L1 VLPs,并具有良好的免疫原性。     

两种重组人乳头瘤病毒52型免疫原性检测方法相关性的比较

目的比较两种重组人乳头瘤状病毒52型(human papilloma viruses type 52,HPV52)免疫原性检测方法的相关性。方法分别采用假病毒体外中和试验(pseudovirus based neutralization assay,PBNA)及酶联免疫吸试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫后小鼠血清中HPV52型中和抗体滴度,比较两种检测方法的相关性。结果重组四价HPV疫苗免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0. 765,P 0. 01;不同状态HPV52型VLP蛋白颗粒免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0. 809,P 0. 01。结论采用PBNA法检测的HPV52型中和抗体滴度与ELISA法检测的抗体滴度具有较高的相关性。     

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素-α1b条件的优化

目的对聚乙二醇(PEG)衍生物化学修饰重组人干扰素-α1b(rhIFN-α1b)的条件进行优化。方法以3种不同的第2代PEG衍生物对rhIFN-α1b进行修饰,SDS-PAGE分析PEG及修饰产物的表观相对分子质量。对反应pH值、温度、时间、修饰剂用量等修饰条件进行优化,并对修饰产物进行初步分离纯化和活性检测。结果PEG的电泳表观相对分子质量大于其理论值;PEG20000的修饰率(92.1%)高于PEG5000和PEG10000;修饰剂用量和pH值是主要影响因素,最佳pH为9.0,rhIFN-αlb与PEG20000的最佳摩尔比为1∶10,时间和温度影响甚微。单点修饰产物保留了14.4%的体外活性,多点修饰产物无活性。结论选择了合适的PEG衍生物并优化了修饰条件,为进一步深入研究奠定了基础。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质

目的制备聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素α1b(rhIFNα1b),并分析其部分性质。方法采用PEG修饰rhIFNα1b,通过离子交换层析分离纯化修饰混合物,单点修饰产物经超滤浓缩后,经Lowry法检测蛋白的浓度,SDS-PAGE和RP-HPLC检测蛋白的纯度,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点,质谱法检测蛋白的相对分子质量,细胞病变抑制法检测蛋白的体外活性,ELISA法检测蛋白的抗原性。结果单点修饰产物的蛋白得率为33%;SDS-PAGE分析纯度为96.1%,RP-HPLC分析纯度为98.1%;等电点为6.22;相对分子质量为39946;比活为1.28×106IU/mg,活性保留率为14.4%;抗原性至少降至原来的1/625。结论制备的单点修饰rhIFNα1b药学性质获得改善,有望开发为安全、长效的新型干扰素。     

间充质干细胞及基因转移方法促进新骨生成和大节段骨缺损的修复

目的构建含人骨形态蛋白-2(BMP-2)基因的重组腺病毒,并转染入间充质干细胞,诱导其向骨细胞分化,从而生成新骨并修复骨缺损。方法用重组腺病毒作为载体,将人BMP-2基因转染入小鼠胚胎间充质干细胞,Western blot检测BMP-2蛋白的分泌表达。观察重组腺病毒Adv-BMP-2转染后小鼠间充质干细胞的增殖变化,并进行碱性磷酸酶活性、钙化结节形成和细胞中成骨相关蛋白mRNA转录水平等细胞分化的指征检定。将Adv-BMP-2转染后的小鼠间充质干细胞注入裸鼠右侧大腿四头肌内,观察新骨生成情况。将重组腺病毒Adv-BMP-2转染的大鼠骨髓间充质干细胞用于大鼠大节段骨缺损的修复,并对植入的骨髓间充质干细胞进行跟踪观察。结果Western blot分析表明,重组腺病毒Adv-BMP-2转染的细胞可分泌表达BMP-2蛋白。转染后的小鼠间充质干细胞的增殖速度与重组腺病毒Adv-BMP-2的转染量呈剂量相关。Adv-BMP-2转染的干细胞碱性磷酸酶上升,并在体外形成钙结节,同时,成骨相关蛋白Osteopontin、Osteocalcin、Bone sialoprotein及Collagenα1(I)的mRNA水平也上升。用Adv-BMP-2转染的间充质干细胞能在裸鼠的大腿肌肉内形成发育成熟的新骨,转染的自体性骨髓间充质干细胞能有效修复大鼠大节段股骨缺损。在免疫抑制剂FK506的支持下,Adv-BMP-2转染的同种异体骨髓间充质干细胞也能修复大鼠的大节段骨缺损。没有FK506支持下的Adv-BMP-2转染的同种异体骨髓间充质干细胞及重组腺病毒Adv-β-gal转染的骨髓间充质干细胞则不能在体内形成新骨。植入骨缺损部位的骨髓间充质干细胞能直接参与骨缺损的修复,且有向全身其他组织器官迁移的趋势,但生存期较短。结论用腺病毒介导的BMP-2基因转染入间充质干细胞能有效诱导干细胞向骨细胞分化,生成新骨并修复骨缺损。     

混合补料诱导高拷贝重组毕赤酵母高效表达X-HBsAg

目的对高拷贝重组毕赤酵母表达X-HBsAg的诱导策略进行优化。方法在摇瓶中分别诱导1、4、8拷贝数的重组毕赤酵母,ELISA检测X-HBsAg的表达量;在15L发酵罐中对8拷贝的重组毕赤酵母进行诱导表达,分别考察甘油浓度对菌体比生长速率的影响、过渡阶段混合补料对菌体生长及细胞相对活性的影响、诱导阶段比生长速率对目的蛋白表达的影响以及诱导阶段混合补料对目的蛋白表达的影响。结果 8拷贝的重组毕赤酵母在摇瓶中诱导表达的X-HBsAg量明显高于1和4拷贝重组子。优化的发酵诱导策略为:初始补加甘油阶段控制甘油浓度在15g/L;过渡阶段采用甲醇与甘油混合补料,控制甘油浓度在限制性浓度以下;诱导阶段采用甲醇与甘油混合诱导X-HBsAg表达,诱导初始阶段控制比生长速率在0.015/h以上,中后期在0.002/h左右;发酵92h,X-HBsAg的表达量比单纯甲醇诱导提高约67%。结论混合补料诱导较单纯甲醇诱导策略更有利于高拷贝重组毕赤酵母表达X-HBsAg。