HBsAg/GM-CSF融合蛋白的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达HBsAg/GM-CSF融合蛋白。方法利用PCR扩增HBsAg和GM-CSF基因,通过15个氨基酸的连接肽将两个片段连接,获得融合基因S-GM,克隆入酵母穿梭质粒pPIC9K中。将重组质粒9K-S-GM电转化毕赤酵母后,G418筛选,甲醇诱导,HBsAg/GM-CSF融合蛋白表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测表达产物特异性。结果PCR扩增的片段与预期大小一致,HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达。Western blot检测,该融合蛋白同时具有HBsAg和GM-CSF的特异性。结论该融合蛋白的获得为提高乙肝疫苗的免疫原性奠定了科学基础。     

人乳头瘤病毒31型L1病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达及其免疫原性初步评价

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLP),并初步评价其免疫原性。方法构建HPV31 L1四拷贝重组表达质粒,电转化毕赤酵母KM71,甲醇诱导表达蛋白。将重组菌经30 L发酵罐发酵,产物分离纯化,用纯化样品免疫小鼠,采用半数有效剂量(median effective dose,ED50)初步评价表达产物的免疫原性。结果经双酶切鉴定,四拷贝重组表达质粒构建正确。表达产物可与小鼠抗HPV L1单抗发生特异性结合。纯化产物在透射电镜下为直径60 nm的VLP结构,相对分子质量约55 000,纯度达95%以上。小鼠体内效价ED50值为0. 018μg。结论成功在毕赤酵母中表达了HPV31型L1 VLP,其在小鼠体内具有良好的免疫原性。     

SARS病毒S2蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的研究用毕赤酵母菌表达SARS病毒S2蛋白亚单位。方法依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成SARS病毒刺突蛋白S2亚单位的基因(1590bp),再与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-S2,转化毕赤酵母GS115,并经MD和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-S2。经诱导、表达,并对表达产物进行分析、鉴定。结果所构建的重组质粒pPIC9K-S2正确,在毕赤酵母中可高效表达,其表达产物与阳性SARS血清产生特异性反应。结论SARS病毒刺突蛋白S2亚单位可在毕赤酵母中高效表达,产物具有良好的抗原特异性。     

重组人乳铁蛋白基因克隆及表达

目的　构建重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株 ,并对表达产物进行评价。方法　由外周血白细胞总RNA经RT- PCR克隆获得HLF基因结构cDNA ,测序后克隆入酵母表达载体获得质粒pPIC9K- HLF ,线性化后电转化入毕赤酵母 ,经G4 -18 YPD筛选多拷贝后进行甲醇诱导表达。结果　获得基因与GenBank中的人HLF0 1基因基本相符。 2株多拷贝菌株诱导表达产物均能与人HLF抗体反应 ,具有抑制大肠杆菌生长的作用。结论　获得了能分泌有活性HLF的重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株。     

HIV-1 Vpu蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的在毕赤酵母中表达并纯化人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)辅助调节蛋白Vpu。方法从质粒p CDNA3.1-vphu中PCR扩增vphu基因,插入毕赤酵母表达载体p PICZαA,构建重组表达质粒p PICZαA-vphu,转化巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达带有6×His标签的重组Vpu蛋白。表达产物经Ni-Agarose 6×His标签纯化柱纯化。表达和纯化产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒p PICZαA-vphu经双酶切和测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约16 000,主要存在于细胞内;纯化后杂蛋白减少,与抗VPU抗体和抗His标签抗体均可结合,浓度为224μg/ml。结论利用毕赤酵母表达系统成功表达并纯化了HIV-1 Vpu蛋白,纯化的蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究其结构和功能以及靶点药物筛选模型的建立奠定了基础。     

人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性

目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。     

恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统的构建及表达

目的构建恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统并进行表达。方法应用基因重组技术构建含pfs25基因的醇氧化酶启动子1(Alcohol oxidase promoter 1,AOX1)重组质粒pICpfs25和三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP)重组质粒pGAPpfs25,取酶切鉴定和测序正确的重组质粒电转化毕赤酵母菌GS115,获得毕赤酵母重组体ICpfs25和GAPpfs25,并构建含两种启动子的酵母重组体IC-GAP/2pfs25,甲醇诱导pfs25基因表达,Western blot分析表达产物的反应原性,ELISA分析各重组体表达上清中Pfs25蛋白的含量。结果各重组体的表达产物经SDS-PAGE分析均可见相对分子质量约25 000的Pfs25蛋白条带,双启动子重组体Pfs25蛋白的表达量约占表达上清的70%,明显高于单一启动子重组体,且双启动子重组体Pfs25蛋白的表达量随着补加甲醇量的增加而逐渐增加;各重组体的表达产物均可与小鼠抗Pfs25单抗4B7特异性结合;双启动子重组体表达上清的ELISA反应明显强于其他重组体表达上清。结论已构建了恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统,两种启动子共同作用可明显提高目的蛋白的表达量。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆猪血清白蛋白(PSA)基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。     

重组HBsAg在汉逊酵母中的分泌表达

目的构建重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌型汉逊酵母工程菌株,并进行诱导表达。方法在HBsAg基因前加酿酒酵母α前导肽(MFα)基因序列作为信号肽,将整个序列优化为汉逊酵母优选密码子,采用搭桥PCR方法分别合成后,通过1对引物PCR法融合在一起。将融合基因插入汉逊酵母穿梭质粒pDGXHP2.0的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子下游,构建成多拷贝分泌型重组表达载体。将其电转化多型汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌ATCC34438(Ura3-),筛选分泌表达HBsAg的汉逊酵母工程菌株,并比较在YPD、BMMY、MM3种培养基中分泌表达HBsAg的水平,ELISA检测培养上清液中HBsAg的表达量,透射电镜观察类病毒颗粒(VLPs)。结果构建了HBsAg汉逊酵母多拷贝表达质粒pDGXHP2.0-2MFα-HBsAg和pDGXHP2.0-4MFα-HBsAg,筛选获得了分泌表达HBsAg的汉逊酵母HP/2MFα-HBsAg和HP/4MFα-HBsAg。经诱导,工程菌株在YPD培养基中分泌表达的HBsAg量高于在BMMY和MM中的表达量;ELISA定量检测表达量最高可达10μg/ml,培养上清液经透射电镜观察,形成了VLPs。结论HBsAg在汉逊酵母中能够分泌表达,并能形成VLPs,但表达量低于胞内表达量。     

白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建白细胞介素-10(IL-10)基因多拷贝表达盒,提高IL-10在毕赤酵母中的表达水平。方法体外构建重组表达载体αIL-10/pAO815,BamHⅠ和BglⅡ双酶切获得目的基因表达盒(AOX-αIL-10),再连接到BglⅡ酶切位点处,依次构建多拷贝重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815。从质粒pPIC9K上用NdeⅠ和SalⅠ双酶切获得Kan抗性基因,重组到多拷贝表达载体n(AOX-αIL-10)/pAO815上。重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815电转化毕赤酵母,PCR筛选含有IL-10基因的酵母转化子,甲醇诱导表达,对表达量高的转化子再次经重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan电转化,高浓度G418抗性筛选二次酵母转化子,使用甲醇诱导表达。ELISA测定IL-10含量,MC/9细胞测定IL-10活性。结果所构建的8拷贝表达盒的重组载体8(AOX-αIL-10)/pAO815和4拷贝表达盒4(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan,转化子分泌表达IL-10水平最高,为(8.25±1.65)mg/L,比活性为1.465×105U/mg。结论已成功构建了高拷贝表达盒,并提高了IL-10在毕赤酵母中的表达水平。     

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。     

拷贝数对毕赤酵母重组菌表达猪胰岛素前体的影响

通过5 L发酵罐补料分批培养,分析了猪胰岛素前体(PIP)基因拷贝数对毕赤酵母生长、细胞存活率和基因稳定性的影响.结果表明,在甘油阶段和甲醇诱导初期拷贝数对毕赤酵母的生长无显著影响,但在甲醇诱导24 h后高拷贝数毕赤酵母菌株(12拷贝重组菌A2和18拷贝重组菌A3)的比生长速率明显比低拷贝数菌株(1拷贝重组菌G1和6拷...     

多拷贝脑钠肽基因表达质粒的构建及其表达

目的构建多拷贝脑钠肽(BNP)基因重组表达质粒,并探讨BNP基因的拷贝数与其表达水平的相关性。方法通过人工合成和PCR技术扩增BNP基因,将其克隆至载体pCW111中,构建表达质粒pBNP11,并通过亚克隆构建含有不同数量表达盒的正向串联表达质粒,分别转化大肠杆菌DH5α和BL21(DE3),经温度诱导表达,SDS-PAGE分析,并经激光扫描测定目的蛋白的表达量。结果测序及酶切鉴定证明1～3拷贝BNP重组表达质粒构建正确,重组蛋白在大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)中均可获得表达,表达量分别为菌体总蛋白的8.12%、9.94%、和9.18%。结论已构建了多拷贝BNP的重组表达质粒,BNP的表达水平随BNP拷贝数的增加而升高,但并未成倍增加。     

胆盐水解酶基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)基因。方法以重组质粒pMD18-BSH为模板,PCR扩增BSH基因,克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,经AvrⅡ线性化,电转化至毕赤酵母SMD1168,PCR筛选阳性重组子,诱导表达,表达产物经Western blot进行分析。结果重组表达质粒pGAPZαA-BSH经双酶切及测序证明构建正确;经PCR鉴定阳性的重组酵母菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约35000的目的蛋白表达条带;表达的重组蛋白可与兔抗植物乳杆菌多克隆抗体发生特异性反应。结论在毕赤酵母中成功表达了BSH,为BSH结构与相关功能及高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。     

人巨细胞病毒pp65基因在毕赤酵母中的表达

目的构建表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65336-507基因的毕赤酵母工程菌。方法扩增HCMVpp65336-507基因,构建重组表达质粒pPIC9/pp65336-507,转化毕赤酵母菌GS115。PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达产物。结果已构建和筛选到阳性表达克隆株,表达的pp65336-507蛋白的相对分子质量约为26000,能与特异的pp65抗体结合。结论已成功构建了分泌表达pp65336-507蛋白的毕赤酵母工程菌,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。     

应用毕赤酵母表达中国株HIV-1核心蛋白Gag

目的 构建含HIV-1Gag全长基因的重组酵母表达质粒pPICGAG，并在毕赤酵母中进行表达。方法用Not I和XhoI将含HIV－1 Gag全长基因的质粒pKSGAG双酶切后，克隆到酵母表达载体pPIC9中，构建了重组表达质粒 pPICGAG。pPICGAG用 SacI线性化后，电转化毕赤酵母 GS115，PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将PCR阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果 酵母转化子的整合率为72．7％。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的相对分子质量为55000左右，与预计计算的值相同。Western blot结果显示表达蛋白能与单克隆抗体发生特异性反应。结论 在毕赤酵母中成功地表达了HIV-1核心蛋白Gag，且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。