人乳头瘤病毒18型L1蛋白在毕赤酵母中的表达及其病毒样颗粒的免疫原性

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒18型(Human papilomavirus 18,HPV18)L1蛋白,纯化病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),并检测其免疫原性。方法将含HPV18 L1基因的酵母表达质粒pHPV18 L1电转化毕赤酵母X-33,甲醇诱导表达,重组HPV18 L1蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经离子交换层析、分子筛层析纯化,采用SEC-HPLC分析纯度;动态光散射和透射电镜分析粒径分布和结构;并通过小鼠半数有效剂量(ED50)和大鼠抗体滴度测定分析其免疫原性。结果 HPV18 L1蛋白在毕赤酵母中获得了有效表达,相对分子质量约为55 000,可与小鼠抗HPV18 L1单抗特异性结合;经纯化的HPV18 L1 VLPs纯度为99%,且颗粒大小均一,直径约50 nm;经吸附铝佐剂后,免疫小鼠的ED50为0.006 68μg;并可诱导大鼠产生较高的抗体滴度。结论 HPV18 L1可在毕赤酵母中高效表达并自动形成VLPs,该VLPs经纯化、吸附铝佐剂后具有良好的免疫原性,为工业化生产HPV18 L1疫苗奠定了基础。     

人乳头瘤病毒31和33型L1蛋白类病毒颗粒的制备及其免疫原性

目的采用汉逊酵母系统表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31和33型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs),纯化后检测其免疫原性。方法将表达HPV31和HPV33 L1蛋白的重组汉逊酵母工程菌经高密度发酵,收集菌体,进行高压均质破碎后,采用亲和层析法纯化HPV31和HPV33 L1 VLPs,SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白,透射电镜观察VLPs形态,动态光散射仪分析VLPs粒径大小及分布情况。将BALB/c小鼠随机分为3组:HPV31 L1 VLP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)、HPV33 L1 VLP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)和佐剂对照组(铝含量0.24 mg),分别于0、1、3周经腹腔注射免疫小鼠,于每次免疫后1周经眼球采血,分离血清,采用假病毒中和试验检测血清中和抗体滴度。结果纯化的HPV31和HPV33 L1重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与HPV L1通用型单克隆抗体发生特异性结合。经透射电镜及动态光散射观察,可见VLPs形成,但部分L1蛋白以五聚体的壳粒形式存在,未包装成颗粒。HPV31和33 L1 VLPs初次免疫后1周,即能诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的血清中和抗体,且明显高于佐剂对照组(P0.05),随着免疫次数的增加,HPV31 L1 VLP组和HPV33 L1 VLP组免疫小鼠血清中和抗体滴度也相应增加。结论应用汉逊酵母可高效表达HPV31和HPV33 L1重组蛋白,并形成VLPs。用含铝佐剂的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,具有较好的免疫原性,可作为多价重组HPV疫苗的组分抗原。     

人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性

目的利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 L1 VLP菌种。采用15 L发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 L1VLP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 L1 VLP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 L1 VLP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 L1 VLP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 L1 VLP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/L,且可与小鼠抗HPV L1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 L1 VLP在小鼠体内的半数有效剂量(ED_(50))为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 L1 VLP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。     

人乳头瘤病毒31型L1病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达及其免疫原性初步评价

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLP),并初步评价其免疫原性。方法构建HPV31 L1四拷贝重组表达质粒,电转化毕赤酵母KM71,甲醇诱导表达蛋白。将重组菌经30 L发酵罐发酵,产物分离纯化,用纯化样品免疫小鼠,采用半数有效剂量(median effective dose,ED50)初步评价表达产物的免疫原性。结果经双酶切鉴定,四拷贝重组表达质粒构建正确。表达产物可与小鼠抗HPV L1单抗发生特异性结合。纯化产物在透射电镜下为直径60 nm的VLP结构,相对分子质量约55 000,纯度达95%以上。小鼠体内效价ED50值为0. 018μg。结论成功在毕赤酵母中表达了HPV31型L1 VLP,其在小鼠体内具有良好的免疫原性。     

两种重组人乳头瘤病毒52型免疫原性检测方法相关性的比较

目的比较两种重组人乳头瘤状病毒52型(human papilloma viruses type 52,HPV52)免疫原性检测方法的相关性。方法分别采用假病毒体外中和试验(pseudovirus based neutralization assay,PBNA)及酶联免疫吸试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫后小鼠血清中HPV52型中和抗体滴度,比较两种检测方法的相关性。结果重组四价HPV疫苗免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0. 765,P 0. 01;不同状态HPV52型VLP蛋白颗粒免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0. 809,P 0. 01。结论采用PBNA法检测的HPV52型中和抗体滴度与ELISA法检测的抗体滴度具有较高的相关性。     

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒的特征分析

目的对人乳头瘤病毒18型(human papilloma virus 18,HPV18)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)进行特征分析。方法采用质谱技术分析HPV18 VLPs(重组大肠埃希菌表达系统表达L1蛋白,自组装成为VLPs)蛋白质一级结构,圆二色谱技术分析蛋白质二级结构,高效液相色谱、透射电镜和动态光散射技术分析蛋白质三级和四级结构;同时采用假病毒中和试验分析HPV18 VLPs的免疫原性,SDS-PAGE法分析样品纯度。结果HPV18 VLPs蛋白翻译后修饰主要包括氧化和去酰胺化,完整L1单体分子量约56 000;二级结构中螺旋、折叠、转角、不规则卷曲的比例分别为8. 4%、46. 1%、18. 5%、30. 2%;颗粒纯度达99%以上,且形态饱满完整,大小均一,直径约60 nm。HPV18 VLPs诱导小鼠产生中和抗体滴度的几何均值达3 000以上。HPV18 VLPs中完整L1单体含量达95%以上。结论 HPV18 VLPs结构完整,颗粒大小均一,纯度高,免疫原性良好,本研究为宫颈癌疫苗安全性和有效性的评价奠定了基础。     

汉逊酵母重组表达的人乳头瘤病毒58型类病毒颗粒的免疫效果

目的评价基于汉逊酵母系统的重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLP)的免疫效果。方法将HPV58 L1重组汉逊酵母工程菌转种于3.7 L发酵罐中,经甲醇诱导15 h,收集菌体,高压均质破碎菌体后,采用亲和层析法纯化重组HPV58 L1蛋白,纯化后的HPV58 L1经重构后,经透射电镜观察VLP形态,动态光散射仪分析比较重构与未重构VLP粒径大小及分布情况。将HPV58 L1蛋白(1μg/ml)及HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)分别免疫BALB/c小鼠,免疫后4周采血分离血清,假病毒中和试验比较铝佐剂吸附与未吸附免疫效果;将HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)免疫5组BALB/c小鼠,每组免疫时间均为0、1、3、5、7周,于初次免疫后第1、2、4、6、8周采血,分离血清,假病毒中和试验检测HPV58 L1免疫效果。结果纯化后的重组HPV58 L1蛋白纯度约90%,可与小鼠抗HPV58 L1单克隆抗体发生特异性结合,在相对分子质量约56 000处,可见特异性条带。重构的HPV58 L1VLP直径约为50 nm,界限清晰,颗粒均一度较高,更接近天然病毒的颗粒形态;流体力学直径与天然病毒颗粒更接近,颗粒大小分布更均一,无较小半径的单体或五聚体。HPV58 L1蛋白+佐剂免疫小鼠血清中和抗体滴度明显高于HPV58 L1蛋白免疫组,差异有统计学意义(P<0.05);5组小鼠血清中和抗体滴度在初次免疫后1周即开始升高,第6周达到最高,重构的重组HPV58 L1蛋白可诱导小鼠产生较高水平的中和抗体。结论应用含铝佐剂的HPV58 L1 VLP免疫小鼠,具有较好的免疫学活性,可作为多价HPV疫苗的组分抗原。     

HIV-1病毒样颗粒的纯化及其免疫原性

目的纯化HIV-1病毒样颗粒,并检测其免疫原性。方法稳定表达HIV-1结构蛋白Gag和Env的重组293细胞经大规模培养后,收集培养上清,经30%蔗糖垫两次纯化,免疫BALB/c小鼠,Western blot检测小鼠血清中抗体水平。结果重组293细胞培养上清的纯化产物经SDS-PAGE分析,可见目的蛋白的表达。Western blot检测显示,纯化蛋白具有良好的反应原性。免疫小鼠后能够诱导产生针对目的蛋白的抗体,其抗体水平呈剂量依赖关系。结论纯化的HIV-1病毒样颗粒能够诱导小鼠产生抗体,具有良好的免疫原性。     

大规模纯化脊髓灰质炎病毒的蔗糖垫层离心法的建立

目的建立可大规模纯化脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)的蔗糖垫层离心法。方法病毒大量增殖后,收集病毒液,经PEG浓缩、三氟三氯乙烷抽提后,采用蔗糖垫层或Cs Cl密度梯度离心法纯化PV(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型),电镜下观察病毒形态,进行核酸及感染性滴度的检测。将纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV免疫豚鼠,心脏采血,分离血清,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果蔗糖垫层离心法纯化的各型PV,病毒颗粒形态典型,背景清晰,除完整的光滑型病毒颗粒外,还可见大量空心病毒颗粒样品,纯化效果较好;Cs Cl密度梯度离心法纯化的PV样品,病毒形态也较典型,但完整的病毒颗粒较多。两种纯化方法获得的病毒基因组核酸特征显著,背景清晰,无明显差异。蔗糖垫层离心法纯化的各型PV的感染性滴度及免疫后豚鼠血清中和抗体滴度均高于Cs Cl密度梯度离心法。结论蔗糖垫层离心法纯化的PV纯度高,免疫原性好,可用于大规模纯化PV或其他病毒。     

柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

目的应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性。方法对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体p Fast Bac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMVP1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定。对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20%蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90%以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清Ig G滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358。结论应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考。