人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性

目的利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 L1 VLP菌种。采用15 L发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 L1VLP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 L1 VLP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 L1 VLP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 L1 VLP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 L1 VLP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/L,且可与小鼠抗HPV L1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 L1 VLP在小鼠体内的半数有效剂量(ED_(50))为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 L1 VLP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。     

重组人乳头瘤病毒33型L1病毒样颗粒的表达、纯化及免疫原性评价

目的利用毕赤酵母表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)33型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),评价其在小鼠体内的免疫原性。方法构建HPV33 L1表达质粒,电转化毕赤酵母,筛选高表达菌株,15 L发酵罐发酵,离子交换和凝胶体积排阻层析分离纯化HPV33 L1 VLPs,纯化后样品免疫小鼠,采用假病毒中和试验检测小鼠免疫后血清中和抗体滴度。结果质粒HPV33 L1-pPIC3. 5K经双酶切及测序鉴定证明构建成功;毕赤酵母表达产物经Western blot分析,可见相对分子质量约56 000的目的条带;透射电镜下可见直径约60 nm的病毒样颗粒;纯化后的HPV33 L1 VLPs纯度可达95%以上;0. 4和0. 04μg HPV33 L1 VLPs免疫后小鼠血清中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为3 200和566,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论利用毕赤酵母成功表达了HPV33 L1 VLPs,并具有良好的免疫原性。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在毕赤酵母中的表达及其病毒样颗粒的免疫原性

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒18型(Human papilomavirus 18,HPV18)L1蛋白,纯化病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),并检测其免疫原性。方法将含HPV18 L1基因的酵母表达质粒pHPV18 L1电转化毕赤酵母X-33,甲醇诱导表达,重组HPV18 L1蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经离子交换层析、分子筛层析纯化,采用SEC-HPLC分析纯度;动态光散射和透射电镜分析粒径分布和结构;并通过小鼠半数有效剂量(ED50)和大鼠抗体滴度测定分析其免疫原性。结果 HPV18 L1蛋白在毕赤酵母中获得了有效表达,相对分子质量约为55 000,可与小鼠抗HPV18 L1单抗特异性结合;经纯化的HPV18 L1 VLPs纯度为99%,且颗粒大小均一,直径约50 nm;经吸附铝佐剂后,免疫小鼠的ED50为0.006 68μg;并可诱导大鼠产生较高的抗体滴度。结论 HPV18 L1可在毕赤酵母中高效表达并自动形成VLPs,该VLPs经纯化、吸附铝佐剂后具有良好的免疫原性,为工业化生产HPV18 L1疫苗奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白VLP的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白病毒样颗粒(VLP),并进行纯化,为研制宫颈癌疫苗提供新的思路。方法以HPV16基因组DNA为模板,PCR扩增HPV16L1基因的编码区,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)编码区下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用GST纯化柱纯化重组融合蛋白,并用凝血酶切去GST标签,再经S100分子筛纯化,浓缩后,电镜观察纯化蛋白的VLP形态。结果重组表达质粒经双酶切和测序,证明构建正确。表达产物的相对分子质量约为80000,主要以可溶性形式存在。Western blot显示,目的蛋白可与小鼠抗HPV16L1抗体发生特异性反应。纯化蛋白的纯度约为95%,在电镜下可见直径约为50～60nm的VLP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性的HPV16L1蛋白VLP,并进行了纯化,为宫颈癌疫苗及血清学诊断试剂的研制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒31和33型L1蛋白类病毒颗粒的制备及其免疫原性

目的采用汉逊酵母系统表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31和33型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs),纯化后检测其免疫原性。方法将表达HPV31和HPV33 L1蛋白的重组汉逊酵母工程菌经高密度发酵,收集菌体,进行高压均质破碎后,采用亲和层析法纯化HPV31和HPV33 L1 VLPs,SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白,透射电镜观察VLPs形态,动态光散射仪分析VLPs粒径大小及分布情况。将BALB/c小鼠随机分为3组:HPV31 L1 VLP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)、HPV33 L1 VLP组(蛋白含量0.5μg,铝含量0.24 mg)和佐剂对照组(铝含量0.24 mg),分别于0、1、3周经腹腔注射免疫小鼠,于每次免疫后1周经眼球采血,分离血清,采用假病毒中和试验检测血清中和抗体滴度。结果纯化的HPV31和HPV33 L1重组蛋白相对分子质量约为56 000,可与HPV L1通用型单克隆抗体发生特异性结合。经透射电镜及动态光散射观察,可见VLPs形成,但部分L1蛋白以五聚体的壳粒形式存在,未包装成颗粒。HPV31和33 L1 VLPs初次免疫后1周,即能诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的血清中和抗体,且明显高于佐剂对照组(P0.05),随着免疫次数的增加,HPV31 L1 VLP组和HPV33 L1 VLP组免疫小鼠血清中和抗体滴度也相应增加。结论应用汉逊酵母可高效表达HPV31和HPV33 L1重组蛋白,并形成VLPs。用含铝佐剂的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,具有较好的免疫原性,可作为多价重组HPV疫苗的组分抗原。     

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。     

HPV 16 L1天然变异体在毕赤酵母中的可溶性表达及病毒样颗粒装配

目的在毕赤酵母中表达两个临床人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型毒株主要衣壳蛋白L1(HPV 16 L1),并分析表达产物的可溶性及病毒样颗粒(virus-like parcticle,VLP)装配差异。方法将编码两个不同HPV 16毒株L1蛋白的全长基因序列M16和Y16分别重组于毕赤酵母表达载体p Pink LC,构建重组表达质粒Y16LC和M16LC,转化表达菌株p Pink strain 1。重组菌经甲醇诱导后,Western blot分析L1蛋白的表达水平及可溶性。经密度梯度离心结合透射电镜观察,分析VLP装配情况。通过软件pubmed在线Alignment分析两个序列的氨基酸排列。结果两个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证明构建正确。两个序列获得了相似的蛋白表达水平,但Y16的可溶性较差,几乎且无VLP形成;而M16呈现较好的蛋白可溶性及VLP装配能力。Y16与M16有5个氨基酸的差异(H202D、T266A、Δ424S、D441Δ、K452Q)。结论 HPV 16 L1氨基酸的微小改变尽管未对重组蛋白的表达水平产生影响,但显著影响有功能的预期产物的获得。提示在基因重组病毒疫苗研发中,制备VLP时需考虑毒株的选择,甚至主动进行抗原的特定氨基酸的改造。     

GⅡ.21型诺如病毒衣壳蛋白VP1的表达、纯化及鉴定

目的构建含有GⅡ.21型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1基因的重组质粒,通过PichiaPink毕赤酵母表达VP1蛋白,并鉴定纯化产物。方法合成NoV GⅡ.21 VP1蛋白基因序列,将其连接至pPink-HC载体,构建重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1;经测序鉴定后,电转化毕赤酵母PichiaPink,甲醇诱导目的蛋白表达;采用AKTA pure M150型纯化仪纯化目的蛋白,Western blot法分析其抗原性,SEC-HPLC法检测纯化蛋白出峰时间。结果经测序鉴定,重组质粒pPink-HC-GⅡ.21-VP1构建正确;纯化的目的蛋白VP1纯度在95%以上,能与抗NoV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗体发生反应;测定目的蛋白出峰时间为16. 923 min,与NoV VLP理论出峰时间一致。结论成功在毕赤酵母高表达了GⅡ.21衣壳蛋白VP1,并制备了高纯度及良好抗原性的目的蛋白,为多价重组NoV疫苗的研发及规模化生产奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

目的应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性。方法对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体p Fast Bac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMVP1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定。对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20%蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90%以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清Ig G滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358。结论应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考。     

汉逊酵母重组表达的人乳头瘤病毒58型类病毒颗粒的免疫效果

目的评价基于汉逊酵母系统的重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型L1蛋白类病毒颗粒(virus-like particles,VLP)的免疫效果。方法将HPV58 L1重组汉逊酵母工程菌转种于3.7 L发酵罐中,经甲醇诱导15 h,收集菌体,高压均质破碎菌体后,采用亲和层析法纯化重组HPV58 L1蛋白,纯化后的HPV58 L1经重构后,经透射电镜观察VLP形态,动态光散射仪分析比较重构与未重构VLP粒径大小及分布情况。将HPV58 L1蛋白(1μg/ml)及HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)分别免疫BALB/c小鼠,免疫后4周采血分离血清,假病毒中和试验比较铝佐剂吸附与未吸附免疫效果;将HPV58 L1蛋白+佐剂(蛋白含量1μg/ml,铝含量0.41 mg/ml)免疫5组BALB/c小鼠,每组免疫时间均为0、1、3、5、7周,于初次免疫后第1、2、4、6、8周采血,分离血清,假病毒中和试验检测HPV58 L1免疫效果。结果纯化后的重组HPV58 L1蛋白纯度约90%,可与小鼠抗HPV58 L1单克隆抗体发生特异性结合,在相对分子质量约56 000处,可见特异性条带。重构的HPV58 L1VLP直径约为50 nm,界限清晰,颗粒均一度较高,更接近天然病毒的颗粒形态;流体力学直径与天然病毒颗粒更接近,颗粒大小分布更均一,无较小半径的单体或五聚体。HPV58 L1蛋白+佐剂免疫小鼠血清中和抗体滴度明显高于HPV58 L1蛋白免疫组,差异有统计学意义(P<0.05);5组小鼠血清中和抗体滴度在初次免疫后1周即开始升高,第6周达到最高,重构的重组HPV58 L1蛋白可诱导小鼠产生较高水平的中和抗体。结论应用含铝佐剂的HPV58 L1 VLP免疫小鼠,具有较好的免疫学活性,可作为多价HPV疫苗的组分抗原。     

乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水的治理技术

乙烯酮(双乙烯酮)是十分重要的化工中间体,其下游产品较多。江苏某化工厂开发生产乙烯酮(双乙烯酮)下游产品三十多个,年生产规模三万多吨,是国内以乙烯酮(双乙烯酮)为中间体生产精细化学品的综合骨干企业。针对乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水特点,该厂结合企业实际,开展了产品优化,结构调整,清洁生产,资源循环利用,节水降耗等工作,从源头削减了污染物的生产。同时投资二千多万元新建预处理装置三套,6000m3/d废水生化处理装置一套,使全厂乙烯酮(双乙烯酮)下游产品的废水得到了有效的治理。     

分解炉扩径的技术改造

我厂3号回转窑(Φ4m×60m)生产线在1996年年底由SP窑(产量912t/d)改为NSP窑(产量1320t/d),预分解系统为四级旋风预热器带离线式分解炉     

水泥水化热测定方法综述

水泥水化热是中、低热水泥和核电工程用水泥的一项关键的技术指标。全球范围内测定水泥水化热的方法有溶解法、直接法/半绝热法、等温传导量热法三种。本文总结了中、美、欧相关方法标准,对其测试原理、仪器设备、试验过程等方面进行了比对,并对其在领域的应用做了简单的概括。     

生物油的成分分析及物性测定

以添加FeCl2的ZnCl2-KCl混合熔盐裂解纤维素和秸秆,制得生物油。采用傅立叶变换红外光谱法和气相色谱-质谱法分析生物油的成分。结果表明,生物油中成分复杂,含有氧元素、多种有机化合物,主要包括酮类、醛类、酚类及羧酸类等。测定了20～80℃生物油的密度和粘度,发现生物油的密度与温度呈较好线性关系,而生物油的粘度均大于水的粘度,且不同熔盐体系对秸秆生物油的粘度无较大影响。     

Effect of degree of deacetylation of chitosan on the kinetics of ultrasonic degradation of chitosan

The objective of the study was to explore the effect of the degree of deacetylation (DD) of the chitosan used on the degradation rate and rate constant during ultrasonic degradation. Chitin was extracted from red shrimp process waste. Four different DD chitosans were prepared from chitin by alkali deacetylation. Those chitosans were degraded by ultrasonic radiation to different molecular weights. Changes of the molecular weight were determined by light scattering, and data of molecular weight changes were used to calculate the degradation rate and rate constant. The results were as follows: The molecular weight of chitosans decreased with an increasing ultrasonication time. The curves of the molecular weight versus the ultrasonication time were broken at 1‐h treatment. The degradation rate and rate constant of sonolysis decreased with an increasing ultrasonication time. This may be because the chances of being attacked by the cavitation energy increased with an increasing molecular weight species and may be because smaller molecular weight species have shorter relaxation times and, thus, can alleviate the sonication stress easier. However, the degradation rate and rate constant of sonolysis increased with an increasing DD of the chitosan used. This may be because the flexibilitier molecules of higher DD chitosans are more susceptible to the shear force of elongation flow generated by the cavitation field or due to the bond energy difference of acetamido and β‐1,4‐glucoside linkage or hydrogen bonds. Breakage of the β‐1,4‐glucoside linkage will result in lower molecular weight and an increasing reaction rate and rate constant. © 2003 Wiley Periodicals, Inc. J Appl Polym Sci 90: 3526–3531, 2003     

Process of acceleration of filtration of viscose

Conclusions It is significant that the purification on a single passage of viscose through porous ceramic corresponds to the result of a two-stage filtration of it in industrial filter-presses with standard fillings.Kiev Combine. Kiev Technological Institute of Light Industry. Translated from Khimicheskie Volokna, No. 3, pp. 20–22, May–June, 1969.     

基于组件技术的化工原理实验课件的设计

利用组件技术开发化工原理实验课件,给出了系统层、组件库层和应用层的架构划分。重点讨论了组件库的设计,给出了流体阻力这一典型实验的实现描述。实践证实,基于组件技术可以提高仿真实验的开发效率。