重组人proEMAPⅡ/p43体外抑制新生血管生成活性方法的建立

目的建立proEMAPⅡ/p43蛋白体外检测抑制新生血管生成活性的方法。方法利用内皮细胞增殖实验、细胞周期实验、细胞迁移实验、管腔形成实验、鸡胚绒毛尿囊膜实验等体外检测血管生成的模型,研究p43蛋白抑制血管生成的活性。结果 p43蛋白能明显抑制内皮细胞迁移和管腔形成,但对内皮细胞增殖和细胞周期没有明显的量效关系。结论最终选用细胞迁移实验和管腔形成实验作为主要活性检测方法,细胞迁移实验作为p43蛋白活性的定量检测方法,迁移抑制率作为活性高低的评价标准,管腔形成实验用于p43蛋白活性的定性研究。     

p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞迁移及体外血管生成的影响

目的 观察p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及体外血管生成的影响,探讨p54nrb基因在血管新生中作用.方法 用含有靶向人p54nrb基因shRNA的慢病毒感染HUVEC 24h后,用嘌呤霉素进行筛选,Western blotting检测HUVEC中p54nrb蛋白的表达,确定p54nrb基因沉默效率,建立稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8法检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞增殖的影响;划痕实验和Transwell迁移实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞迁移的影响;体外血管生成实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC体外血管生成能力的影响.结果 Western blotting结果显示,p54nrb基因沉默的HUVEC细胞中p54nrb蛋白表达显著减少,表明建立了稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8实验结果显示,p54nrb基因沉默轻度地促进了HUVEC细胞增殖;划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,p54nrb基因沉默后HUVEC细胞迁移能力明显下降;体外血管生成实验结果显示,p54nrb基因沉默明显抑制了HUVEC的体外血管生成能力.结论 p54nrb具有促进HUVEC细胞迁移及体外血管生成的作用,可能是一个新的参与血管生成的调控蛋白.     

重组人proEMAP Ⅱ/p43蛋白N端和C端结构域的构建及活性鉴定

目的构建表达重组人proEMAPⅡ蛋白N端（p43N）及C端（p43C）结构域,并进行活性鉴定。方法分别在大肠杆菌中表达p43N及p43C蛋白,并纯化获得目的蛋白;利用血管内皮细胞管腔形成实验及细胞迁移实验进行活性鉴定,并比较等摩尔浓度下,p43蛋白、p43N、p43C及p43N＋p43C的活性差异。结果 p43N及p43C均具有抑制内皮细胞管腔形成和迁移的活性,在等摩尔浓度条件下,p43蛋白的生物活性高于p43N和p43C,p43N活性最弱,但p43N和p43C共同作用时,抑制活性高于单独作用。结论获得具有生物活性的p43N及p43C蛋白,为进一步确定p43N作用机制及其与p43C相互关系奠定了基础。     

新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂对结肠癌细胞的增殖抑制作用

目的：观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）JZ004对结肠癌细胞系HCT-8和HT-29细胞增殖的影响,并初步探讨其抗癌机制。方法用不同浓度JZ004分别处理HCT-8和HT-29细胞, MTT法检测细胞的增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期停滞、细胞凋亡;若丹明（rhodamine）123和二氯二氢荧光素二乙酸酯（ DCFH-DA）测定细胞线粒体跨膜电位及活性氧（ reactive oxygen species ,ROS）产生的变化;免疫印迹法检测细胞内乙酰化组蛋白H3、p21、细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）4、Bcl-2、Mcl-1、Bax等相关蛋白的表达水平。结果MTT结果显示,JZ004对结肠癌细胞系的增殖有明显抑制作用,其抑制效果与时间、剂量呈正相关;流式分析结果显示,细胞凋亡率随JZ004浓度提高而增加;JZ004处理72 h后,p21表达水平上调,CDK4蛋白表达下调,细胞周期停滞于G0／G1期而抑制细胞的生长,细胞内ROS产生增多,且线粒体跨膜电位显著下降,促凋亡蛋白Bax的表达呈上调趋势,而抑凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1表达则受到抑制。结论 JZ004作为一种新型的HDACi对结肠癌细胞具有明显的抑制生长和诱导凋亡作用,凋亡诱导机制可能与Bcl-2家族蛋白表达水平变化有关。提示JZ004具有成为结肠癌临床化疗药物的潜能。     

AMPKα信号途径参与吡格列酮对人肝癌细胞的凋亡诱导作用

目的观察吡格列酮干预对体外培养的HepG2细胞凋亡和细胞周期的影响,并探讨其药理作用机制。方法以不同浓度的吡格列酮干预体外培养HepG2细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期以及激活的胱天蛋白酶（Caspase）3蛋白表达,RT-PCR检测PPARγmRNA的表达,Western印迹检测PPARγ蛋白、磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPKα）蛋白和磷酸化AMPKα（p-AMPKα）蛋白的表达;并将PPARγ小干扰RNA（pGCsi-PPARγ）表达质粒转染HepG2细胞,观察PPARγ基因沉默后吡格列酮对细胞凋亡作用的影响。结果不同浓度的吡格列酮干预HepG2细胞后,诱导细胞的凋亡,在此过程中G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,并呈一定的剂量依赖关系;但在上述过程中,PPARγmRNA和蛋白的表达没有显著变化;吡格列酮在高浓度（20μmol/L）时对pGCsi-PPARγ表达质粒转染的HepG2细胞仍表现出凋亡诱导作用。不同浓度的吡格列酮干预后未见激活的caspase 3表达峰,对NF-κB的DNA结合活性也无明显影响,但其在高浓度（20μmol/L）时明显增加对照组和pGCsi-PPARγ转染组p-AMPKα的表达,而总AMPKα则无明显变化。结论吡格列酮能够干扰细胞周期、诱导其凋亡,这种作用不是完全通过PPARγ依赖途径实现的,AMPKα信号途径参与上述过程。     

缝隙连接蛋白43在X射线诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用及机制研究

目的 研究缝隙连接蛋白43（Cx43）在X射线致人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡中的作用并探讨其机制。方法 采用流式细胞术检测10 Gy X射线照射后48~96 h以及不同剂量X射线照射后72 h HUVEC细胞凋亡的变化。Western blot检测0、5、10、20 Gy X射线照射后72 h HUVEC中Cx43和cleaved caspase-3蛋白的表达。采用RNA干扰技术使细胞Cx43表达沉默,或转染Cx43高表达质粒使Cx43过表达。流式细胞术和Western blot分别检测Cx43沉默和过表达对受照HUVEC凋亡的影响以及cleaved caspase-3蛋白表达水平的变化。结果 X射线照射后48~96 h HUVEC凋亡增加并且呈现剂量依赖性。在0~20 Gy范围内,Cx43表达随剂量增加而降低,cleaved caspase-3表达随剂量增加而增高。Cx43沉默组HUVEC细胞早期凋亡及凋亡死亡细胞比例明显高于无意义序列组（t=3.674、6.375,P<0.05）;Cx43过表达组HUVEC细胞早期凋亡及凋亡死亡细胞比例明显低于空载体组（t=9.399、11.190,P<0.05）;Cx43沉默组较无意义序列组cleaved caspase-3表达增强,而过表达组低于空载体组。结论 Cx43通过调控cleaved caspase-3活化,抑制HUVEC细胞凋亡,从而对X射线照射的HUVEC细胞发挥保护作用。     

干扰素λ诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞抗增殖机制的研究

目的探查干扰素λ诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞抗增殖的机制。方法流式细胞术检测细胞周期,膜联蛋白Ⅴ（annexinⅤ）和PI双染检测凋亡,Western印迹检测凋亡蛋白的表达。结果干扰素λ诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞的亚G1期（sub-G1）升高,干扰素λ处理细胞与膜联蛋白Ⅴ的结合增加,干扰素λ可诱导细胞内半胱天冬酶（caspase）3的剪切,caspase抑制剂可减少干扰素λ诱导的sub-G1期升高。结论干扰素λ可诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞发生凋亡。     

辅酶NADH抑制人肝细胞株L02化疗凋亡损伤的作用

为研究辅酶NADH对顺铂（DDP）诱导的肝细胞凋亡的抑制作用及其分子机制，采用透射和扫描电镜检测肝细胞超微结构改变，碘化丙啶染色流式细胞术检测细胞凋亡，RT－PCR检测p53和bcl-2基因表达变化，并用紫外分光光度法测定凋亡分子caspase-3和caspase－8活性水平的改变。结果显示，与DDP组比较，NADH／DDP组典型凋亡超微形态改变不明显，细胞凋亡明显下降，p53基因表达下降，bcl-2基因表达上升，caspase-3和caspase-8活性维持在低水平。提示NADH具有明显抑制DDP诱导肝细胞凋亡的作用。     

电场对血管内皮细胞增殖及其细胞周期的影响

目的 观察电场对血管内皮细胞增殖的影响并探讨其作用机制。方法 将血管内皮细胞分别暴露于场强为50mVmm^-1,100mVmm^-1和200mVmm^-1的电场7。部分细胞接受细胞凋亡抑制剂Z－VAD－FMK的同时暴露于200mVmm^-1的电场。计算细胞密度，生长率和分裂指数，行细胞凋亡信号蛋白caspase-3免疫荧光染色，以流式细胞仪行细胞周期时相分析和通过蛋白印记分析检测细胞周期调节蛋白的表达。结果 50mVmm^-1或100mVmm^-1的电场暴露对细胞增殖没有明显影响，但200mVmm^-1的电场细胞增殖明显受抑，表现为细胞密度，生长率及分裂指数明显下降。Z－VAD－FMK未能防止电场暴露所诱发的细胞增殖的抑制。电场暴露细胞未见有明显的caspase-3阳性染色。电场暴露细胞的细胞周期时相图上，亦未见提示细胞凋亡的亚G1峰，而显示其细胞周期的G1／S过渡受抑。电场暴露细胞的Cdk2表达不受影响，但Cyclin-E的表达明显降低，而cyclin-E/Cdk2复合物的抑制蛋白p27^kip1的表达则明显增加。结论 电场暴露通过诱发细胞周期停滞而非细胞凋亡抑制血管内皮细胞的增殖，该作用是籍增加p27^kip1的表达和减少cyclin-E的表达而实现。     

三氧化二砷诱导血管内皮细胞凋亡和抑制血管生成的实验研究

 目的研究三氧化三砷(As2O3)抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)生长、诱导凋亡和抑制血管生成的作用.方法As2O3与HUVECs共同孵育一定时间后,观察细胞形态学变化,并用MTT方法测定细胞生长抑制率、TUNEL方法检测细胞凋亡;观测As2O3对鸡胚血管生成的影响.结果在0.75～6 μmol/L浓度范围内随药物浓度增加或作用时间延长,细胞生长抑制和细胞凋亡效果越显著;As2O3作用鸡胚绒毛尿囊膜后血管生成减少.结论As2O3抑制HUVECs生长、诱导细胞凋亡,对血管生成有抑制作用.     

三氧化二砷诱导血管内皮细胞凋亡和抑制血管生成的研究

目的：研究三氧化二砷(As2O3)抑制血管内皮细胞(HUVECs)生长、诱导凋亡和抑制血管生成的作用。方法：As2O3与HUVECs共同孵育一定时间后，观察细胞形态学变化，并用MTT方法测定细胞生长曲线图、TUNEL方法检测细胞凋亡；观测As2O3对鸡胚血管生成的影响。结果：在0．75μmol／L～6μmol／L浓度范围内随药物浓度增加或作用时间延长，细胞生长抑制和细胞凋亡效果越显著；As2O3作用鸡胚绒毛尿囊膜后血管生成减少。结论：As2O3抑制HUVECs生长、诱导细胞凋亡，对血管生成有抑制作用。     

低浓度乙醇诱导与紫外线照射对HepG2细胞周期及p53/p21蛋白表达的影响

目的观察低浓度乙醇诱导与紫外线照射导致HepG2肝癌细胞损伤的分子路径。方法选用HepG2肝癌细胞株，分别给予低浓度乙醇诱导与紫外线照射处理，观察两种损伤因素作用后细胞周期分布的差异，细胞中p53蛋白和p21蛋白表达的改变，分析蛋白表达与细胞周期改变的关系。结果紫外线照射后细胞中p53、p21蛋白表达均明显增强，出现G0～G1／G2～M期阻滞；低浓度乙醇诱导后主要出现G2～M期阻滞与p21蛋白表达的增强，p53蛋白表达改变不明显；两种损伤因素均能导致细胞凋亡率的增加。结论低浓度乙醇诱导与紫外线照射通过激活细胞内不同的分子事件，导致细胞周期与细胞凋亡的改变。     

EGCG改善D-gal诱导阿尔茨海默病模型大鼠认知障碍机制研究

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)通过抑制p75NTR介导的凋亡通路相关因子改善D-gal诱导阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆障碍的作用及其机制。方法以Morris水迷宫观察动物行为学变化,TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,同时采用免疫组化及Western blot法检测其脑内Cleaved-Caspase-3表达水平,并用Western blot法检测p75NTR介导的凋亡通路相关蛋白表达水平。结果 EGCG明显改善D-gal诱导AD模型大鼠学习记忆障碍,抑制其脑内TUNEL阳性细胞表达,降低凋亡特征性蛋白Cleaved-Caspase-3的表达水平。同时,EGCG可通过抑制p75NTR介导的凋亡相关通路,显著降低p75ICD表达水平及其下游JNK2、c-Jun磷酸化水平,降低下游凋亡相关蛋白p53的表达水平,从而发挥抗凋亡、改善学习记忆障碍的抗AD作用。结论 EGCG可能通过抑制p75NTR介导的JNK/c-Jun/p53凋亡相关信号通路,抑制D-gal诱导AD模型大鼠脑内神经细胞凋亡,从而改善其认知障碍。     

长链非编码RNA punisher对血管平滑肌细胞

目的探究长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）punisher与动脉粥样硬化的关系及其对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法12只健康纯种雄性8周龄载脂蛋白E（apolipoprotein E,ApoE ）基因敲除小鼠（ApoE-/- 小鼠）,通过高脂饲喂制作动脉粥样硬化模型小鼠（模型组）;12只健康C57BL/6J小鼠饲以基础饲料为对照组;人体血管平滑肌细胞系根据转染情况分为小干扰-punisher组和阴性对照（negative control,NC）组。通过荧光定量聚合酶链反应测定模型组与对照组小鼠主动脉弓的punisher表达。通过合成punisher的小干扰RNA作为反向对照抑制punisher在人血管平滑肌细胞中的表达,应用实时荧光定量聚合酶链反应验证punisher表达情况;分别采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）、划痕实验及流式细胞术检测抑制punisher表达对人血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响;蛋白印迹法检测B淋巴细胞瘤-2（B-cell leukemia-lymphoma-2,Bcl-2）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase3）、caspase8、p-p38、p53凋亡相关蛋白的表达。结果①血脂4项及血管苏木精-伊红染色证明造模成功。荧光定量聚合酶链反应显示,动脉粥样硬化模型组小鼠血管punisher表达高于对照组（P＜0.05）;②CCK-8检测显示小干扰-punisher组的光密度值在转染36h之后低于NC组（t36=2.683、P＜0.05,t48=2.554、P＜0.05）;划痕实验显示小干扰-punisher组细胞迁移低于NC组（t=3.136、P<0.05）;③流式细胞术显示,小干扰-punisher组中凋亡细胞数占比多于NC组（22.6%和11.7%,χ2=4.245、P＜0.05）;④蛋白印迹法显示小干扰-punisher组Bcl-2、caspase3-30×103、p53蛋白表达水平明显低于NC组（t分别为9.546、5.647、5.42,P＜0.05）,caspase3-17×103蛋白表达水平高于NC组（t=4.892、 P＜0.05）。结论沉默lncRNA punisher可以促进血管平滑肌细胞的凋亡并抑制其增殖。     

糖皮质激素对血管内皮炎性损伤的保护机制

目的 探讨糖皮质激素对血管内皮细胞的保护机制.方法 以脂多糖(LPS)致伤体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)复制内皮细胞炎性损伤模型,观察地塞米松(Dex)作用后其IL-6、可溶性胞间黏附分子1(sICAM-1)分泌及细胞凋亡率的变化,以及糖皮质激素受体拮抗剂RU486对地塞米松作用的影响.结果 LPS诱导后HUVEC凋亡率达36.7%±3.9%,而Dex对此有明显抑制作用,可使凋亡率降至13.2%±0.9%(P＜0.01).在LPS刺激下,HUVEC分泌IL-6和sICAM-1的量明显增多.Dex可以明显抑制LPS诱导的IL-6、sICAM-1分泌和HUVEC凋亡,且呈一定的浓度依赖性,Dex浓度增加到10-6mol/L时,其抑制效应达最大值,继续增加Dex的浓度到10-5mol/L和10-3mol/L时,并不能再增强其效应.RU486可逆转Dex的作用.结论 糖皮质激素可通过糖皮质激素受体途径抑制IL-6与sICAM-1的分泌和细胞凋亡,对血管内皮细胞的炎性损伤起到保护作用.     

2-氯脱氧腺苷(2-CDA)诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡的机制探讨

目的探索2-氯脱氧腺苷(2-CDA)诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡的机制。方法取对数生长期A375细胞,MTT比色法检测2-CDA对其体外增殖的抑制作用,Annexin V/PI双标法流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测细胞内蛋白水平的变化。结果 2-CDA对A375细胞增殖具有明显抑制作用,且随浓度增加及作用时间延长而逐渐增强,48h时的半数抑制浓度(IC50)为3.04μmol/L;Annexin V/PI双染并经流式细胞术检测显示2-CDA能够明显诱导细胞凋亡;Western blotting检测显示2-CDA能够显著下调Stat3的磷酸化水平,2-CDA作用后细胞凋亡信号蛋白caspase-3发生剪切而活化,导致其下游蛋白PARP发生剪切而诱导细胞凋亡。结论 2-CDA可通过抑制Stat3蛋白活性并激活Caspase-3而诱导A375细胞发生凋亡。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对肝癌细胞增殖的抑制作用研究

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 采用不同浓度(0、25、50、100、200、400mg/L)EGCG作用于HepG2细胞,于24、48h后采用MTT方法检测细胞增殖抑制率.以不同浓度(0、50、100、200mg/L)EGCG作用于HepG2细胞,24h后采用流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期、细胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)及Smad3蛋白的表达,RT-PCR检测CDC25A和Smad3 mRNA的表达.结果 MTT检测结果显示,不同浓度EGCG对HepG2细胞均有生长抑制作用,且具有时间和剂量依赖性(P＜0.01).随着EGCG浓度升高,细胞增殖指数(PI)明显降低(P＜0.01),细胞凋亡率明显增高(p＜0.01),CDC25A蛋白和mRNA表达水平下降(p＜0.05),Smad3蛋白和mRNA表达水平上升(p＜0.05).结论 EGCG可能通过下调CDC25A、上调Smad3的表达,抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡,从而对肝癌细胞起到生长抑制作用.     

60Coγ射线对大鼠星形胶质瘤细胞增殖抑制作用的机理研究

目的 研究^60Coγ射线对大鼠星形胶质瘤细胞的增殖抑制作用的机制。方法 ^60Coγ射线单次照射，分为对照组、4、16和64Gy组。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生长曲线。照射后48h采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布，免疫组化法检测P53及P21蛋白的表达。结果 16和64G主y组C6细胞出现明显的增殖抑制。随着吸收剂量的增大，凋亡比例显著增加（P〈0．01），G0／G1期的细胞比例增加，S期的细胞比例降低。野生型p53与p21随着照射剂量增加，表达增强。P53与P21蛋白表达强度呈正相关，相关系数斜率为0．889。结论 γ射线对大鼠星形胶质瘤细胞系C6细胞的增殖抑制通过诱导细胞凋亡和G1期阻滞实现，G1期阻滞的分子调控通路可能为p53-p21通路。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导HeLa细胞p21WAF1/CIP1表达的分子机制研究

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDIs）诱导肿瘤细胞产生周期阻滞以及诱导p21^WAF1／CIP1表达的分子机制。方法：以人宫颈癌HeLa细胞为模型，用曲古抑茵素A（TSA）处理HeLa细胞，通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡，通过Western印迹及RT-PCR检测周期相关分子的蛋白及mRNA的表达；并构建TSA靶分子启动子区的荧光素酶报告质粒，进一步检测TSA的主要作用位点，寻找相关作用途径。结果与结论：TSA可诱导HeLa细胞发生周期阻滞，并呈现明显的剂量和时间依赖关系，加大用药剂量及延长用药时间可诱导凋亡。TSA可显著诱导p21^WAF1／CIP1的表达，表现为转录水平的调节，其变化可以指示周期阻滞的程度。p21^WAF1／CIP1启动子区3′端是TSA作用的主要位点，同样被TSA诱导表达增加的p53很可能通过与其效应元件的结合而使TSA诱导p21^WAF1／CIP1表达的总效果增强。     

神经酰胺和p53在AngⅡ诱导内皮细胞凋亡过程中的作用

目的 探讨AngⅡ诱导内皮细胞凋亡过程中神经酰胺和p53的作用及相互关系.方法 体外培养脐静脉内皮细胞,分别用血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)拮抗剂氯沙坦、血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)拮抗剂PD123319、神经酰胺合成酶抑制剂烟曲霉素B1(FB1)、p53抑制剂PFT-α预处理细胞,再加入AngⅡ,24h后与对照组(用双蒸水预处理细胞)比较,观察细胞凋亡情况,RT-PCR和Western blot检测各组p53表达情况.结果 PD123319和FB1能显著抑制AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡,而氯沙坦和PFT-α则不能抑制AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡.FB1和PFT-α可以抑制p53的mRNA和蛋白表达.结论 AngⅡ通过AT2受体和神经酰胺诱导内皮细胞凋亡.神经酰胺在AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡过程中起重要作用,且可能经过p53诱导凋亡.