饥饿大鼠胰岛胰高血糖素和嗜铬颗粒素A变化的定量免疫组织化学研究

用免疫组织化学ＡＢＣ法结合图像分析技术，研究饥饿状态下大鼠胰岛胰高血糖素（ｇｌｕｃａｇｏｎ，Ｇｌｕ）和嗜铬颗粒素Ａ（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ，ＣｇＡ）的含量变化。结果表明，与正常对照组相比，饥饿大鼠胰岛Ａ细胞中Ｇｌｕ含量明显下降，ＣｇＡ含量仅在饥饿５ｄ后显著下降。这提示饥饿可导致Ｇｌｕ释放快速增加，而ＣｇＡ释放增加却较为缓慢。与饥饿５ｄ大鼠组相比较，饥饿５ｄ后静脉注射葡萄糖（１ｇ／ｋｇ体重）９０ｍｉｎ后胰岛Ａ细胞内Ｇｌｕ含量明显升高，ＣｇＡ含量无显著变化。提示静脉注射葡萄糖可作用于胰岛Ａ细胞，使Ｇｌｕ释放快速减少，但对ＣｇＡ的释放无影响。以上结果表明，外源性葡萄糖对胰岛Ａ细胞中Ｇｌｕ和ＣｇＡ两种物质的作用机制不同，为进一步阐明胰岛内Ｇｌｕ和ＣｇＡ的不同生理作用提供了形态学依据。     

采用罗丹明123对肝癌细胞系MHCC97(Rholow)干细胞亚群的分离及鉴定

目的 建立分离肝癌细胞系MHCC97细胞中对罗丹明123染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌干细胞和异质性研究中的意义.方法 利用流式细胞分选术(FCM)并结合不同浓度的罗丹明123(Rho123)染料,分析和分选肝癌细胞系MHCC97细胞中具有不同染料排斥能力的肝癌细胞亚群,再通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法,以比较不同肝癌细胞亚群的差异.结果 根据不同染料排斥能力可以将肝癌细胞系MHCC97细胞分为Rholow和Rhohigh2个亚群,2个亚群在增殖能力、克隆形成率以及甲胎蛋白(AFP)和角蛋白-19(CK-19)表达以及裸鼠成瘤实验上差异有统计学意义,Rholow亚群具有干细胞特性.结论 罗丹明123结合FCM可以富集具有干细胞特性的Rholow亚群,同时为进一步揭示肝癌异质性机制奠定基础.     

Cyclin D1在胶质瘤细胞系中表达分布模式的初步研究

目的：探讨cyclin D1在胶质瘤细胞系中的细胞周期表达模式，将为从生物学功能上阐明cyclin D1在胶质瘤细胞周期演进中的作用．方法：利用流式细胞仪双参数法和细胞同步化，确定cyclin D1在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中的细胞周期表达分布模式．结果：在胶质瘤细胞系SHG-44和BT-325中，Cyclin Dl的表达呈细胞周期依赖性：在SHG-44中，cyclin D1在G1期表达最高，4h左右达到峰值，S期及G2／M期下降，但仍可检测到；在BT-325中，cyclin D1在G1期表达最高，6h左右达到峰值，S期及G2／M期下降，但仍可检测到．结论：cyclin D1蛋白质的表达呈细胞周期依赖性，且与细胞周期行进有关；cyclin D1在SHG-44和BT-325胶质瘤细胞进入G1期的早期发挥着重要的生物学作用。     

识别不同结构域的PTA1/CD226的mAb与活化血小板的关系

目的:研究识别不同PTA1/CD226分子结构域的mAb与刺激血小板活化的关系。方法:采用识别不同结构域的抗PTA1/CD226的mAb(FMU17),应用免疫荧光染色、流式细胞术和血小板凝集试验,研究识别不同结构域mAb对血小板的活化作用。结果:识别CD226第1个结构域的3株mAb(FMU1、2和3)可以与血小板结合,并可刺激血小板发生凝集,而识别CD226第2个结构域的mAbFMU6、FMU7以及识别两个结构域之间序列的FMU4和FMU5既不能与血小板表面天然的CD226分子结合,也不能刺激血小板活化。结论:抗PTA1/CD226mAb刺激血小板活化与抗体识别的结构域有关。     

树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

趋化性细胞因子对人Tc1和Tc2细胞内Ca~(2+)浓度变化的影响

为了探讨趋化性细胞因子在体外对人Tc1和Tc2亚群细胞内Ca2 + 浓度变化的影响 ,从PBMC中分离纯化CD8+ T细胞 ,在特定细胞因子及细胞因子抗体作用下 ,体外定向诱导出能长期培养的Tc1和Tc2细胞系 ,用免疫荧光染色结合流式细胞术分析对其进行鉴定后 ,通过流式细胞术检测在趋化性细胞因子刺激前后 ,细胞内Ca2 + 浓度的变化。发现受SDF 1作用后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 浓度变化均不明显 ,而IP 10刺激后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 水平在短时间内明显上调 ,且在Tc1胞内的上升幅度远高于Tc2细胞 ,在MIP 1β刺激后 ,也观察到类似趋势 ;受Eotaxin刺激后 ,Tc1及Tc2细胞内Ca2 + 水平均有微小上升 ,在Tc2细胞内的上升幅度略高于Tc1细胞。说明Tc1和Tc2细胞受趋化性细胞因子作用后 ,细胞内Ca2 + 浓度有不同程度的变化 ,且与趋化性细胞因子受体的表达呈现一定的相关性。     

趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群的差异表达

目的研究趋化性细胞因子受体在体外长期培养的人Te1和Tc2细胞系中的表达。方法将新鲜分离的PBMC在特定细胞因子及细胞因子抗体存在条件下，定向诱导为Ⅰ型和Ⅱ型T细胞系，用免疫荧光染色结合流式细胞术分析鉴定，并以膜表面及胞内三色流式细胞术检测趋化性细胞因子受体在不同T细胞亚群的表达。结果①在Ⅰ型和Ⅱ型T细胞整体水平上，CXCR4的表达水平接近，CXCR3和CCR5的表达在Ⅰ型T细胞明显高于Ⅱ型T细胞，CCR3在2种T细胞系的表达水平均较低，但在Ⅱ型T细胞的表达略高于Ⅰ型T细胞；②趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群细胞的表达与上述结果类似，即CXCR的表达水平接近，CXCR3和CCR5的表达在Tc1高于Tc2，CCR3的表达水平较低，但在Tc2则略高于Tc1。结论趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群的表达具有差异性。     

流式细胞术外周血样品间标的方法

目的　建立一种新的用于流式细胞术 (FCM)外周血样品的间标荧光染色方法 .方法　抗凝全血 1 0 0 μL,加入一抗 5 0μL ,室温下反应 30 min,上 Q- PREP型免疫学样品制备仪 ,溶解红细胞和固定标品 ,加入荧光二抗 5 0 μL ,室温下反应 30 min,再加入 5 0 0 μL 的 PBS制成单细胞悬液 ,上流式细胞仪分析 ,同时与其他 5种常规方法进行比较 .结果　本方法与其他 5种方法的 FCM测定结果基本一致 (P>0 .0 5 ) ,而本方法样品用量少 ,操作简单 ,快速、染色时间仅需 70 m in.结论　我们建立的外周血样品间接荧光染色法 (方法 2 ) ,是外周血 FCM样品染色的理想方法 ,该方法对于 FCM在临床检验和基础研究的应用提供了技术支持 ,具有较强的实用价值 .     

Effects of varied interferons in combination with all-trans retinoic acid （ ATRA ） on proliferation and differentiation of ATRA-resistent APL cell

Objective：To investigate the effects and mechanisms of interferon in combination with alltrans retinoic acid （ATRA） on proliferation and differentiation of ATRA-resistent APL cell. Methods ：After MR2 cells （ATRA-resistance cell line） were treated with IFN-α, IFN-γ and ATRA alone or IFN-α and IFN-γ in combination with ATRA respectively. The cell proliferation was tested by MTT test and the cell differentiation was tested through light microscope by NBT test and flow cytometry （FCM）. The expres sion of promyelocytic leukemia （PML） protein was observed by indirect immune fluorescent method. Results： Both IFN-α and IFN-γ could inhibit the proliferation and induce the differentiation of MR2 cells to some extent. The effects were more obvious after both interferons in combination with ATRA respectively （P〈0.05）. Moreover, the maturation of MR2 cells induced by IFN-γ＋ATRA group was more higher than that by IFN-α＋ATRA group （P〈0. 05）. Both interferons could induce the expressions of PML protein. Conclusion：Both interferons can inhibit MR2 cells proliferation, which may be related to the expression of PML protein induced by both interferons. The inducing differentiation effects of IFN-γ＋ATRA group on MR2 cells are more powerful than those of IFN-aq-ATRA group, which may be related to the different signal transduction pathway of both interferons.     

拓扑异构酶Ⅰ抑制剂对K562细胞的杀伤与诱导凋亡作用

背景与目的:近年发现,拓扑异构酶Ⅰ抑制剂对加速期或急变期的慢性髓细胞白血病有较好疗效.为了深入理解拓扑异构酶Ⅰ抑制剂这一新的药理作用,本研究采用具有慢性髓细胞白血病特征性异常染色体[t(9;22)]的K562细胞株为实验对象,进一步探讨拓扑异构酶Ⅰ抑制剂拓扑替康(topotecan)对靶细胞的杀伤与诱导凋亡活性.方法:采用MTT法测定拓扑替康对K562细胞的杀伤作用;通过形态学与AnnexinVFITC染色,研究拓扑替康对靶细胞的促凋亡活性;采用caspase 8特异性抑制剂IETD fmk,分析拓扑替康介导的细胞杀伤或凋亡和caspase活化的关系.结果:经0 15μmol/L拓扑替康处理至12、24、48及72h时,K562细胞的存活率与对照相比,逐渐降至(92±36)%[P>0 05vs(94±27)%]、(68±21)%[P<0 05vs(119±13)%]、(54±15)%[P<0 05vs(132±31)%]及(21±10)%[P<0 01vs(114±19)%];同时,靶细胞出现磷脂酰丝氨酸外翻、细胞固缩、染色质边集、核碎裂,最终解离为大量凋亡小体;经caspase 8抑制剂与拓扑替康联合处理至24、48h时,K562细胞的存活率依然维持在(95±29)%与(87±11)%,后者显著高于单用拓扑替康者[P<0 05vs(54±15)%],且无明确的凋亡小体形成.结论:拓扑异构酶Ⅰ抑制剂拓扑替康对K562细胞具有较强的杀伤活性与诱导凋亡作用,该过程可能依赖caspase 8的活化.