Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物。方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系。结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出3个高表达品系。结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型。     

脑组织特异表达S100B转基因小鼠的建立

目的S100B在多种神经损伤性疾病中高表达,高浓度的S100B蛋白对中枢神经系统具有毒性作用。建立脑组织特异表达S100B转基因小鼠,用于研究该基因在帕金森病(Parkinson's disease,PD)发病中的作用。方法ELISA法检测S100B蛋白在α-synuclein A53T转基因小鼠脑组织中的表达情况。构建PDGF-hS100B表达载体,显微注射法建立S100B转基因小鼠。PCR鉴定转基因鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平。Rota-rod实验检测S100B转基因鼠的运动协调能力。结果S100B在9月龄和12月龄α-synucleinA53T转基因小鼠脑组织中的表达高于野生型小鼠。建立了2个品系的脑组织特异表达S100B转基因小鼠。与野生型小鼠相比S100B转基因小鼠表现出明显的进行性运动协调能力障碍。结论S100B转基因小鼠的建立为研究该基因在PD中的作用提供了工具。     

pCAG⁃3×flag⁃PP2A Cα转基因小鼠构建及高表达系的筛选

目的：构建过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα转基因小鼠,筛选高表达稳定遗传系,建立PP2A Cα基因相关功能研究模型动物。方法：将Flag蛋白标签序列与鼠源PP2A Cα cDNA 转录本设计成融合基因,插入CAG启动子下游,构建过表达载体pCAG?3×flag?PP2A Cα。通过原核显微注射技术,将线性化pCAG?3×flag?PP2A Cα质粒注射入受精卵雄原核,构建pCAG?3×flag?PP2A Cα过表达模型小鼠,PCR筛选阳性过表达小鼠。提取阳性过表达小鼠组织总蛋白,在蛋白质水平分析转基因小鼠3×flag?PP2A Cα的表达。结果：PCR 鉴定及测序结果证实,pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因载体及过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因小鼠模型构建成功。Western blot筛选转基因高表达系小鼠。结论：筛选得到pCAG?3×flag?PP2A Cα高表达稳定遗传系小鼠。     

心脏过表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型的建立

目的 建立心脏过表达人源PRKAG2 (G100S)的转基因小鼠模型,为进一步研究该人源基因点突变对小鼠心脏发育、形态和功能维持的作用奠定基础.方法 克隆人源基因PRKAG2并构建点突变质粒,将人源PRKAG2 (G100S)插入α肌球蛋白重链(α-MHC)启动子下游,构建转基因表达载体.选用C57BL/6J小鼠为遗传背景,通过显微注射法建立人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型.采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测人源PRKAG2 (G100S)的表达.结果 经过回交繁育后建立了2个品系的心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)的转基因小鼠品系F2代,并通过qPCR、蛋白质印迹法检测,确认了转基因小鼠心脏组织中人源PRKAG2(G100S)在rmRNA和蛋白水平存在过表达,且该突变能在转基因小鼠中稳定传代.结论 本研究成功建立了心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,人源PRKAG2 (Gl00S)基因在心脏组织的过度表达在小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步深入研究与探讨.     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用.方法 Western blot检测小鼠NOL3表达谱.构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠.PCR 鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型.结果 NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变.通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加.单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化.结论 成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具.     

S100A16基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的:构建S100A16原核表达载体,制备S100A16蛋白多克隆抗体并初步鉴定?方法:RT-PCR扩增得到小鼠肝脏组织的S100A16基因,将此片段克隆到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21(DE3)?IPTG诱导融合蛋白表达,以亲和层析的方法纯化His-S100A16融合蛋白?纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫新西兰白兔制备抗血清?分别采用ELISA和Western blot方法检测抗体效价和特异性?结果:经双酶切和核酸序列分析证实成功构建pET-28a-S100A16原核表达质粒?考马斯亮兰染色结果证实IPTG可有效诱导融合蛋白表达?用纯化融合蛋白免疫新西兰白兔得到的S100A16抗体血清,经ELISA和Western blot检测结果显示该抗体效价高,特异性好?结论:构建带有His标签的S100A16原核表达载体,并获得高纯度His-S100A16融合蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究S100A16生物学功能奠定基础?     

S100A16基因敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的：S100A16在肥胖以及多种恶性肿瘤发生发展中发挥了重要作用,本研究拟构建S100A16基因敲除小鼠模型。方法：利用基因表达调控系统(即Cre/lox P系统)构建全身敲除小鼠。采用聚合酶链式反应(PCR)鉴定小鼠的基因型,采用实时定量PCR(QRT-PCR)、Western blot方法验证其转录及翻译水平的表达。结果：成功建立了S100A16全身敲除小鼠模型,基因敲除杂合子小鼠成功饲养繁殖,目前为止未出现纯合子小鼠。S100A16敲除小鼠主要代谢器官,如脂肪、肌肉、肝脏中S100A16蛋白表达量显著下降。结论：S100A16 基因敲除小鼠模型的构建为研究肥胖及胰岛素抵抗中的作用及机制提供了动物模型。     

神经组织特异表达CTF1转基因小鼠的建立

目的建立神经组织特异表达CTF1的转基因模型小鼠,为研究CTF1生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制的关系提供工具动物。方法把CTF1基因插入神经组织特异的启动子PDGF下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J CTF1转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Western Blot方法鉴定CTF1在脑组织中的表达,对转基因小鼠脑组织进行石蜡切片,HE染色,显微镜观察组织结构形态的改变。结果建立了2个不同表达水平的CTF1转基因小鼠品系。转入的CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态未见异常。结论成功建立了稳定遗传的神经组织特异表达CTF1转基因小鼠品系,为CTF1的生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制关系的研究提供了有力的模型工具。     

UAS-Hey转基因果蝇品系的构建与鉴定

目的 构建UAS-Hey转基因果蝇品系,为研究Hey基因在果蝇发育中的功能提供工具.方法 利用逆转录PCR技术扩增果蝇Hey基因的编码序列,并亚克隆至pUAST表达载体,构建pUAS-Hey重组质粒.显微注射至野生型果蝇的胚胎,通过mini-white标记筛选出UAS-Hey转基因红眼果蝇.将这些转基因品系分别进行平衡与定位,并用PCR扩增方法鉴定.结果 成功构建了pUAS-Hey重组质粒,通过显微注射及转基因果蝇的筛选与平衡,共获得7个独立的转基因品系.PCR分析证实P[mini-white,UAS-Hey]已整合入各转基因品系的基因组,且处于可表达的区域.结论 成功构建了UAS-Hey转基因果蝇,为运用GAL4/UAS系统进一步研究Hey基因的功能与调控奠定了基础.     

心肌特异性Hole转基因小鼠模型的构建与鉴定

目的:建立在小鼠心肌细胞中特异性过表达Hole转基因小鼠。方法:构建心肌特异性过表达Hole的转基因载体,显微注射导入小鼠受精卵,通过胚胎移植,获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测Hole基因整合情况,并通过实时定量PCR检测Hole基因过表达效率。结果:PCR检测发现有6只小鼠在其基因组上整合有Hole载体基因。实时定量PCR结果显示,在心脏组织中Hole基因的转录本表达明显升高。结论:成功建立了在小鼠心肌细胞中特异性过表达Hole转基因小鼠,为研究Hole基因在心脏发育与相关疾病中的功能及机制提供了动物模型。     

fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接，构建pEF-fat-1重组质粒，酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

GAP-43高表达转基因小鼠的建立

目的构建GAP-43(growth associated protein-43)高表达转基因小鼠,为进一步研究GAP-43对神经发生及损伤修复的作用机制提供基础。方法构建pCEP4-PDGF-GAP-43转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pCEP4-PDGF-GAP-43注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过Western blotting法检测GAP-43基因表达,并通过免疫荧光的方法对GAP-43表达位置进行定位。结果经PCR方法检测得到转基因阳性鼠,Western blotting结果显示GAP-43蛋白的表达量高于同胞对照组的小鼠且差异有统计学意义,免疫荧光染色结果显示GAP-43阳性反应物弥散分布于大脑皮质和海马中,且特异性存在于神经元中。结论外源基因GAP-43在小鼠基因组中得到整合并稳定遗传,为神经损伤修复及神经发育的相关研究提供了有价值的动物模型。     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法通过RT-PCR方法克隆人的MTA1编码序列,将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100%,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因,整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠,再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠,为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。     

Sleeping Beauty转座酶转基因小鼠模型的建立

目的建立表达Sleeping Beauty（sB）转座酶转基因小鼠模型,为研究sB转座子在小鼠中的应用提供工具动物。方法利用人的泛素C启动子驱动sB转座酶基因的表达,利用显微注射方法建立C57BL／6J表达sB转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定首建鼠的基因型,Western Blot（WB）和免疫组织化学（IHC）检测SB转座酶基因在小鼠生殖腺睾丸中的表达情况,筛选睾丸中高表达sB转座酶的转基因小鼠。结果通过显微注射方式产生了4只首建小鼠,其中3只能稳定传代,利用WB和IHC成功的筛选出一株在睾丸中高表达sB转座酶的转基因小鼠。结论成功建立了睾丸组织中高表达SB转座酶转基因小鼠动物模型,为将SB转座子应用于建立基因修饰小鼠模型提供非常重要的工具动物。     

小鼠LIF编码基因的克隆与真核表达载体pcDNA3.1-LIF的构建

目的：通过克隆小鼠LIF编码基因,构建pcDNA3.1-LIF真核表达载体,为下一步建立转基因动物模型奠定基础。方法：采用ICR雌性小鼠子宫组织,提取总RNA,运用RT-PCR技术,扩增出小鼠LIF基因全长编码序列,采用同源重组方法构建具有新霉素抗性的小鼠LIF真核表达载体pcDNA3.1-LIF。结果：通过PCR获得了约612 bp大小的特异性cDNA片段。经核苷酸序列分析,扩增得到的片段与小鼠LIF cDNA序列同源性为100%。经PCR及酶切鉴定筛选阳性克隆菌,表明LIF编码序列正确连入pcDNA3.1载体中。结论：成功克隆了小鼠LIF编码基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-LIF。     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

S100A16基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的:构建S100A16基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒,转染3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,初步鉴定其干扰效果.方法:以小鼠S100A16基因为靶基因,以PLKO.1-sP6-GFP质粒为载体,根据GenBank数据库提供的S100A16基因核苷酸序列,选择设计2条siRNA干扰序列,构建针对S100A16基因...     

Expression of human tissue-type plasminogen activator in cow mammary gland]

OBJECTIVE: To construct an expression vector for highly efficient expression of tissue-type plasminogen activator (t-PA) confined in the mammary gland of cow to develop a cow mammary gland bioreactor. METHODS: RT-Touch down-PCR was employed to amplify human tissue-type plasminogen activator (t-PA) cDNA, which was digested with the restriction enzymes and subsequently cloned into the vector pSP72 for constructing specific fusion gene only expressed in the mammary gland. The fusion gene was then transferred into the mouse zygote and the mammary gland tissue of mice and cows. RESULTS: t-PA was detected in the milks of mice and cows after the transgenic manipulation with microinjection and mammary gland injection of the fusion gene. CONCLUSIONS: The vector we constructed can effectively induce t-PA expression in the mammary gland, which is not influenced by different transgenic methods. The expression level of t-PA, however, is significantly higher in the milk of cows than in the milk of mice, suggesting the species-specific difference in milk protein regulating system possibly is due to different factors and regulatory systems.     

小鼠可溶性ST2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠可溶性ST2基因并构建其真核表达载体。方法:从小鼠肥大细胞株P815中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠可溶性ST2基因全长编码区,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mST2,然后进行酶切鉴定和序列分析。结果:小鼠可溶性ST2基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠可溶性ST2基因的全长编码序列为1 011 bp,编码336个氨基酸。结论:用热启动PCR技术能方便、准确地获得目的基因片段。成功地克隆小鼠可溶性ST2基因并构建了其真核表达载体,为进一步进行小鼠可溶性ST2蛋白的表达和功能研究奠定了基础。