融合蛋白TOP_3原核表达载体的构建、表达及纯化研究

目的:利用HIV病毒TAT蛋白转导结构域、人缺氧诱导因子1α氧依赖降解结构域以及CASPASE3构建融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法:分别构建原核表达质粒pET-28a(+)-TAT、pET-28a(+)-TAT-ODD、pET-28a(+)-TAT-ODD-CASPASE3(pET-28a(+)-TOP3);在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白TOP3进行纯化。结果:成功构建了pET-28a(+)-TOP3的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论:融合蛋白TOP3的成功表达及纯化,为该融合蛋白应用于肿瘤的治疗研究奠定了理论基础。     

小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测

目的 RT-PCR扩增小鼠前列腺干细胞抗原(mPSCA)基因,构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA,诱导mPSCA蛋白表达并纯化,并检测mPSCA蛋白的抗原活性。方法利用RT-PCR的方法从小鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞中扩增mPSCA基因,测序正确后PCR的方法去掉mPSCA的信号肽序列将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-mPSCA。将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot检测纯化的蛋白,将纯化蛋白进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价。结果测序结果证实成功扩增出全长mPSCA基因;酶切和测序结果证实pET-42a-mPSCA原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应;ELISA检测显示纯化后的mPSCA抗原具有免疫原性。结论成功扩增出小鼠全长PSCA基因,成功构建了mPSCA基因的原核表达载体,获得了纯化的mPSCA蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

小鼠前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及抗原活性检测

摘要：目的RT-PCR扩增小鼠前列腺干细胞抗原（mPSCA）基因,构建原核表达质粒pET-42a-mPSCA,诱导mPSCA蛋白表达并
纯化,并检测mPSCA蛋白的抗原活性。方法利用RT-PCR的方法从小鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞中扩增mPSCA基因,测序
正确后PCR的方法去掉mPSCA的信号肽序列将其克隆至原核表达载体pET-42a中构建重组载体pET-42a-mPSCA。将其转化
至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,随后将表达的融合蛋白进行纯化。经SDS-PAGE分析后,Western blot检测纯化的蛋白,
将纯化蛋白进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价。结果测序结果证实成功扩增出全长mPSCA基因;酶切和测序
结果证实pET-42a-mPSCA原核表达载体构建成功;转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;Western blot检测证
实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应;ELISA 检测显示纯化后的mPSCA抗原具有免疫原性。结论成功扩增出小鼠全长
PSCA基因,成功构建了mPSCA基因的原核表达载体,获得了纯化的mPSCA蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究
以PSCA为靶点的前列腺癌的免疫治疗奠定了基础。
     

TAT-Apoptin对肿瘤细胞的促凋亡作用

目的构建TAT-Apoptin的原核表达载体,表达并纯化凋亡素蛋白,检测其对多种肿瘤细胞的抑制作用。方法利用PCR合成TAT-Apoptin序列,并将序列连接到pET-28b(+)原核表达载体的多克隆位点上,构建pET-28b-Apoptin载体,然后将重组载体转入E.coli BL21宿主菌,IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和柱进行纯化获得目的蛋白。将TAT-Apoptin加入到肿瘤细胞中,用CCK8法检测TAT-Apoptin对肿瘤细胞的抑制作用。结果成功构建pET-28b-Apoptin质粒,IPTG诱导宿主菌表达TAT-Apoptin,经SDS-PAGE分析,在15×10~3Mr处发现目的蛋白条带,与预期一致。镜检、CCK8法检测发现纯化的TAT-Apoptin对肿瘤细胞A549、MDA-MB-231、SKB-R3均具有一定的促凋亡作用。结论 TAT-Apoptin原核表达载体构建完成,表达的TAT-Apoptin对肿瘤细胞生长有促凋亡作用。     

苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC-823细胞形态的影响

目的:克隆苦瓜蛋白MAP30基因,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,初步研究MAP30蛋白对BGC-823细胞的影响.方法:应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和双酶切鉴定,再进行测序分析,并构建重组表达载体pET-28a-MAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用 NTA-Ni2+ 树脂分离纯化所表达的 MAP30 融合蛋白,并经 SDS-PAGE 电泳鉴定;纯化的蛋白作用于 BGC-823 细胞后通过光镜和电镜进行形态学观察. 结果:成功扩增出MAP30基因为861 bp, 与基因库中公布的DQ643967同源性为100%,与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建 pET-28a-MAP30原核表达重组质粒;通过NTA-Ni2+树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的大小约为30 000的MAP30融合蛋白,与预测一致;蛋白作用细胞后,细胞形态有明显变化.结论:成功构建pET-28a-MAP30表达载体并获得原核表达的MAP30融合蛋白;重组MAP30蛋白能引起BGC-823细胞明显的形态学变化.     

人瘦素基因的原核表达载体构建及其蛋白结构分析

目的 克隆人源Leptin的成熟肽编码序列后基因并构建其原核重组表达菌株,对其产物进行纯化鉴定;生物信息学分析其蛋白质结构并预测功能.方法 提取人脂肪干细胞中的总RNA,经RT-PCR反转录获得cDNA序列,PCR扩增Leptin基因并将其克隆入表达载体pET-28a(+)原核质粒,构建该基因的重组原核表达载体pET-28a-Leptin.随后进行双酶切和测序鉴定.在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,通过WB检测Leptin蛋白的表达;利用在线网络生物信息学相关数据库和分析软件对测序结果进行分析,并对重组蛋白结构及功能等进行验证和预测.结果 PCR扩增得到Leptin目标DNA片段;成功构建重组表达质粒pET-28a-Leptin,经IPTG诱导表达后,目的蛋白在宿主E.coli BL21 (DE3)中高效表达Leptin融合蛋白,相对分子质量18000.生物信息学检索该基因编码蛋白的氨基酸序列与理化参数显示,蛋白无跨膜区,有6个Ser、1个Thr可能为蛋白激酶磷酸化位点,第1～21位可能为信号肽区域.在Leptin氨基酸序列中:α-螺旋93处,无规则卷曲43处,延伸链17处,β-转角14处,分别占总二级结构的55.69％、25.75％、10.18％和8.38％.结论 成功克隆了人的Leptin基因.利用原核载体表达系统成功表达并进一步纯化的Leptin蛋白具有免疫原性.其生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测结果可为深入研究Leptin蛋白的活性作用提供有益借鉴.     

人FcγRIIb胞外区原核表达载体的构建及表达

目的构建人FcγRIIb胞外区蛋白原核表达载体pET-sFcγRIIb,诱导表达并纯化。方法 PCR扩增获得人sFcγRIIb基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析后,转化大肠杆菌BL21,采用不同温度和时间的IPTG诱导蛋白表达,确定最佳诱导条件,SDS—PAGE分析正确后,用镍琼脂糖磁珠纯化。结果扩增出了人sFcγRIIb基因,成功构建原核表达重组质粒pET-sFcγRIIb,30℃10h IPTG诱导表达并纯化出41.5kDa的融合蛋白。结论获得重组人FcγRIIb胞外区蛋白,为以后人FcγRIIb胞外区蛋白功能的深入研究奠定基础。     

hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定

目的 构建人雌激素受体α 亚型配体结合区（hERα-LBD）的原核表达载体,并进行表达蛋白的活性鉴定。方法 以hERα -LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα -LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体（pGEM-T-easy）连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a（+）质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD ,转化到大肠杆菌JM109和BL21感受态细胞中。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白（BSA）偶联抗原(E2-BSA) 与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性。结果 PCR扩增的hERα -LBD基因片段约为1.9 kb,与预期目的片段大小一致。与T载体连接,形成pGM-T-hERα -LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a（+）质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERα-LBD蛋白。经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L。电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性。结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性。     

小鼠IL-13Rα2胞外区基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并在原核表达载体pET-28a中表达小鼠IL-13受体α2(sIL-13Rα2)胞外区基因。方法利用小鼠3T3细胞总RNA,逆转录为cDNA,设计引物,常规PCR法扩增出小鼠sIL-13Rα2基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经双酶切及测序鉴定后,再亚克隆入pET-28a,构建重组质粒pET-28a/sIL-13Rα2,并转化到大肠杆菌BL21感受态细胞。IPTG诱导表达后表达产物经Western blot鉴定。结果PCR扩增产物与预期大小相符合,重组质粒经双酶切鉴定及基因序列测定表明构建正确;sIL-13Rα2蛋白表达以包涵体形式存在,可与山羊抗小鼠sIL-13Rα2单克隆抗体发生特异性反应,相对分子质量约为36 ku。结论成功原核表达sIL-13Rα2基因,为进一步探讨sIL-13Rα2在血吸虫病肝纤维化过程中的调节作用奠定了基础。     

羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定

目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

羊布鲁氏菌M5株P39基因的克隆与分析鉴定

目的:从羊布鲁氏菌M5株全基因组中扩增P39基因,并对扩增产物进行序列测定与分析鉴定。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌全基因组,设计特异性引物通过PCR方法扩增P39基因,将扩增产物连接到T载体(pMD19-T)的多克隆位点(MCS)中,构建成重组体(pMD19-T-P39)。将该重组体转化感受态大肠杆菌DH5(,经克隆筛选并扩增后,采用试剂盒法提取重组质粒,对该重组质粒进行酶切鉴定、序列测定并与GenBank数据库进行比对分析。结果:经PCR方法成功地从羊布鲁氏菌基因组中扩增得到了目的基因片段;酶切鉴定、序列测定与比对结果表明,该目的基因片段即是羊布鲁氏菌P39基因。结论:成功地从羊布鲁氏菌M5菌株全基因组中通过PCR扩增获得了P39基因,为后续的研究提供了可靠的基础。     

结核分枝杆菌突变gyrase A基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌Ser95Thr突变DNA促旋酶A(DNA gyrase A)基因原核表达载体并鉴定,为进一步研究奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用重叠延伸剪切技术,分别通过3次PCR扩增Ser95Thr突变gyrase A基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET-32 a(+),获得重组表达质粒pET-mgyr。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ser95Thr突变gyrase A基因,经过酶切、PCR和测序鉴定,表明突变gyrase A基因正确地插入原核表达载体pET-32 a(+)。结论成功构建了原核表达载体pET-mgyr,为Ser95Thr突变gyrase A基因的功能研究奠定了基础。     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。