弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定

目的：构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性。方法：设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因（双酶切纯化后）定向克隆至质粒pET29a（＋）中,转化到大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21,采用PCR、双酶切和测序等方法鉴定,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况,经镍离子柱纯化重组蛋白后,用蛋白质印迹（Western blotting）分析与小鼠弓形虫阳性血清的免疫反应性。结果：重组质粒经PCR、双酶切反应和测序鉴定,产物的大小与结构均与预期值相符,经IPTG诱导后,稳定表达相对分子量（Mr）为28950的蛋白,纯化后的重组蛋白经Western blotting分析显示,与小鼠弓形虫感染血清有特异性反应条带。结论：成功构建重组表达质粒pET29a（＋）-SAG1,使弓形虫表面抗原SAG1在体外获得表达,分离纯化的SAG1重组蛋白有免疫反应性。     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a( )原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体。方法采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a( ),通过两次定点诱变得到pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度。结果经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1∶100000。结论成功构建pET28a( )-野生型LPL及pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础。     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的 构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a(+)原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体.方法 采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a(+),通过两次定点诱变得到pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度.结果 经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的 蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1:100 000.结论 成功构建pET28a(+)-野生型LPL及pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

小鼠PDL1胞外区的克隆、表达及生物学效应研究

目的：克隆小鼠PDL1膜外区（简称mPDL-1 IgV）基因,构建原核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法：提取小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆mPDL-1 IgV基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,构建原核表达质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR和双酶切鉴定,并测序。筛选阳性菌落,提取质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,同时纯化mPDL-1 IgV蛋白,进行生物学活性检测。结果：从小鼠脾细胞总RNA中成功获得mPDL-1 IgVcDNA克隆,重组质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV构建正确。转化pET28a（＋）／mPDL-1 IgV的E．coli BL21（DE3）成功诱导性表达重组小鼠PDL-1胞外区蛋白,并纯化mPDL-1 IgV蛋白,对其进行了复性和浓缩,复性后的蛋白显示出良好的生物学活性。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠PDL1胞外区蛋白,为进一步研究其功能提供了条件。     

幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌的构建及表达特性研究

目的 构建含有幽门螺杆菌尿素酶（UreI、UreB）及粘附素（HpaA）的多表位原核表达质粒pET28a(+)/ureI-ureB-hpaA〔pET28a(+)/IBA〕及相应的原核表达工程菌,研究其表达特性。 方法 通过生物信息学方法从ureI 、ureB和 hpaA基因中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成并构建原核重组表达质粒pET28a(+)/IBA。经限制性内切酶（Nde Ⅰ,Xho Ⅰ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21 (DE3) 。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（rIBA）的表达情况,以抗幽门螺杆菌悉尼株（SS1株）特异卵黄抗体采用Western blot检测rIBA的抗原性。 结果 构建的多表位原核表达质粒pET28a(+)/IBA双酶切和测序鉴定与设计序列100%一致。工程菌经 IPTG 诱导后SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量40×10 ³左右有一条明显蛋白条带,Western blot显示有相应位置特异反应条带。 结论 成功构建幽门螺杆菌多表位重组原核表达质粒pET28a(+)/IBA及相应原核表达工程菌,该工程菌表达的rIBA具有抗原性,表明该重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

刚地弓形虫TgPRF的原核表达、多克隆抗体制备与应用

目的 原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法 以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗TgPRF多克隆抗体。收集弓形虫RH株速殖子,以制备的多克隆抗体为一抗,Western blotting检测抗体特异性及效价。收集ATc调控下不同时间点的弓形虫iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子进行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗体为一抗,检测TgAPH和TgPRF表达量的变化。结果 SDS-PAGE显示：TgPRF在诱导4 h后表达量趋于饱和,相对分子量为52 ku,且呈可溶性表达。弓形虫RH株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：抗TgPRF多克隆抗体可识别内源性的TgPRF,且该多克隆抗体稀释至1∶10 000时仍可见明显条带;iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：TgAPH的表达量随ATc作用时间的增加呈递减趋势,而TgPRF表达量基本维持恒定。结论 本实验制备的抗TgPRF多克隆抗体特异性和效价良好,可作为衡量弓形虫特定蛋白表达量的内参抗体,也可直接检测内源性TgPRF的表达。     

FGF21[Tyr20]突变体的克隆、表达及纯化

目的：将成纤维细胞生长因子21(FGF21)第20位氨基酸进行突变后,在大肠杆菌中表达,并进行纯化和生物活性检测。方法：以野生型的FGF21为模板,将FGF21第20位氨基酸Tyr进行PCR定点突变成Phe后与小分子泛素样修饰物（SUMO）融合,克隆至pET22b表达载体中,构建重组原核表达质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］,克隆至BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳及Western blotting法进行鉴定,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,SUMO蛋白酶将SUMO切除,Sephadex G-50除盐。结果：通过PCR定点突变,成功地将FGF21第20位氨基酸进行了突变,重组质粒pET22b-SUMO-FGF21［Tyr²⁰］经PCR和双酶切鉴定后测序与预期结果相符。经SDS-PAGE电泳分析,蛋白为可溶性,纯化后成功获得FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白,Western blotting分析显示FGF21［Tyr²⁰］突变体蛋白与FGF21抗体有特异性反应。结论：成功构建并高效可溶性表达SUMO-FGF21［Tyr²⁰］的突变体基因,获得FGF21［Tyr²⁰］蛋白。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET2a相匹配的酶切位点,插入载体pET2a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果 该基因在原核表达系统中经诱导,得到了M_r1000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B6感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.     

Soluble expression and characterization of the immunoreactive multiepitope antigen of Toxoplasma gondii in E.coli]

OBJECTIVE: To obtain soluble expression product of immunoreactive recombinant multiepitope antigen of Toxoplasma gondii from E.coli. METHODS: The gene encoding the multiple epitopes (MEG) of Toxoplasma gondii was amplified by PCR from the original plasmid containing MEG gene and cloned into the prokaryotic soluble expression vector pET32a. After identification by enzyme digestion and sequencing, the positive recombinant plasmid pET32a-MEG was transformed into BL21(DE3), which was induced with IPTG for expression of the target antigen. The relative molecular mass, solubility and antigenicity of the expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. RESULTS: The recombinant expression plasmid pET32a-MEG was successfully constructed and the highly efficient expression of the antigen was achieved after IPTG induction of E.coli. Improvement of the induction condition increased the expression product which accounted for about 28% of the total bacterial protein. The target protein, with good solubility and a relative molecular mass of about 31 000, was purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and could be well recognized by mouse and rabbit antisera derived by infection of the animals with Toxoplasma gondii B36 and RH, respectively. CONCLUSION: The recombinant multiepitope antigen has good antigenicity and potential value in diagnosis and vaccine development of toxoplasmosis.     

脑源性神经营养因子原核表达载体的构建及其生物学活性分析

目的：构建含有脑源性神经营养因子（BDNF）的原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后研究其生物学活性。方法按照大肠杆菌BL21（DE3）的密码子偏好性进行密码子优化,人工合成大鼠BDNF的基因序列并构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF。经限制性内切酶（Bam HI ,Hind Ⅲ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,用SDS‐PAGE检测重组蛋白的表达情况,以BDNF特异性抗体采用Western blot法鉴定BDNF蛋白抗原性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测BDNF蛋白对 PC12细胞活力的影响。结果构建的pET28a（＋）／BDNF经双酶切和测序鉴定与设计序列100％一致;工程菌经IPTG诱导后在相对分子质量17×103左右有1条明显蛋白条带,Western blot显示目的蛋白能够与特异性BDNF抗体反应;不同浓度BDNF蛋白处理组与对照组比较细胞活力均有不同程度的增加,其中50 ng／mL BDNF处理组效果最优。结论成功构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,该工程菌表达的BDNF蛋白具有良好的生物学活性。     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16E7基因，经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体，转化JM109感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7，HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达，在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Ra株fbpC基因的克隆与表达

目的：探讨克隆结核杆菌H37Ra菌株抗原fbpC基因及在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法：通过聚合酶链反应扩增人结核杆菌弱毒性菌株H37Ra的编码基因ibpC,并定向克隆到原核表达载体pET-28a,通过酶切、聚合酶链反应和测序鉴定重组质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）中,由异丙基硫代半乳糖苷诱导表达,十二烷基磺酸纳一聚丙烯酰胺和Westernblot鉴定表达的重组蛋白。结果：成功构建了pET28a—fbpC重组质粒;在大肠埃希菌中表达了相对分子量约33000的重组蛋白。结论：重组质粒pET28a—fbpC成功构建和表达,为fbpc反应原性、免疫诊断价值的研究提供参考。     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

人类8型疱疹病毒K8.1基因原核表达重组质粒的构建

目的：构建人类8型疱疹病毒（HHV-8）K8.1基因原核表达重组质粒,获得HHV-8外壳蛋白重组融合蛋白,为制备检测抗原建立平台。方法：根据基因库K8.1全长基因序列和pET41a载体的多克隆位点设计引物,分别在引物两端添加特异酶切位点,以pGEM-Teasy/K8.1质粒为模板,PCR扩增K8.1基因全长序列,克隆入原核表达载体pET-41a,构建原核表达质粒pET41a-K8.1;转化大肠杆菌DH5α,经酶切、测序鉴定其插入序列的正确性。结果：酶切鉴定表明在约500bp处可见酶切片段,测序结果表明构建的pET41a-K8.1原核表达质粒连接正确,插入的K8.1基因片断为494bp。结论：成功构建了pET41a-K8.1原核表达质粒,为获得重组融合HHV-8外壳蛋白建立了平台。     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

猪囊尾蚴cYI基因表达重组子的建立及在大肠杆菌中的表达

目的研究猪囊尾蚴cYI基因在大肠埃希菌中的表达情况。方法以本室保存的cYI基因为模板,应用PCR技术获得目的基因,运用分子克隆技术,将cYI基因插入到质粒pET28b的NdeI和XhoI位点构建pET28b-cYI重组表达质粒,转化到大肠杆菌DE3后,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法观察其表达情况。结果成功建立了pET28b-cYI重组质粒,并转化到大肠杆菌DE3中表达出相对分子量为18 000的特异性蛋白,表达量为菌体蛋白的30%。结论cYI基因重组子可在大肠杆菌中表达出特异性蛋白,表达量为菌体蛋白的30%。