应用多重PCR方法检测大肠埃希菌O157：H8的初步研究

目的 研究一种快速、特异的检测大肠埃希菌（以下称大肠杆菌）O157：H7的复合PCR方法。方法 选用针对大肠杆菌O157：H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ）和溶血素（Hly)基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157：H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果 除质粒缺失株（933）外,其余11株O157：H7大肠杆菌均在361bp处有溶血素基因产物出现;而12株O157：H8大肠杆菌扩增后的两条志贺样毒素基因产物存在差异,其中6株在210bp、484bp处出现两条相应产物,3株仅有210bp一条SLT－Ⅰ基因产物,另3株仅有484bp的SLT－Ⅱ基因产物。其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌的扩增结果均为阴性。结论 本复合PCR方法具有较高的特异性,可迅速、有效地将O157：H7大肠杆菌与其它常见致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌相鉴别,通过进一步研究有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

多重PCR方法检测大肠杆菌O157:H7的初步研究

目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157：H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157：H7的O157抗原基因（rfbE基因）、鞭毛H7抗原基因（fliC基因）、粘附素基因（eaeA基因）和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因）为扩增对象，设计能导至目的片段大小不同的5对引物，通过优化条件，建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中，检测了5株不同来源的大肠杆菌O157：H7及27株非大肠杆菌O157：H7细菌。结果表明，该方法能从2株大肠杆菌O157：H7中扩增出rfbE、fliC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因，它们的大小分别为582bp、802bp、487bp、368bp和177bp。而另外3株大肠杆菌O157：H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157：H7，还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157：H7．除O149出现SLT-Ⅱ扩增产物和01：H7出现flic基因扩增产物外，其它非大肠杆菌O157：H7的扩增结果均为阴性，表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12h，用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu／g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性，可迅速、有效地将大肠杆菌O157：H7与其它非大肠杆菌O157：H7相区别，同时还能检测O157：H7中的毒力因子。因此，通过进一步研究，本方法有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157

目的根据GenBank中编码大肠杆菌16SrRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为104CFU/ml,含菌3-4CFU/g鸡肉组织样品经预增菌8h后能检出。用此方法检测2000-2004年间从动物组织和粪便中临床分离的64株菌株,结果10株鉴定为大肠杆菌O157,与血清凝集试验结果完全吻合。其中8株能扩增上述5条特异性条带,与预期产物完全一致,2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带,其它54株菌株只能扩增出大肠杆菌16SrRNA。该方法能直接鉴定产多种毒力因子的大肠杆菌O157,特异性强,为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法。     

肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测方法用于食品样品中肠出血性大肠杆菌O157的快速筛查。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以抗EHEC O157 LPS单克隆抗体标记,以兔抗O157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O157胶体金免疫层析检测试纸条,并进行了特异性和敏感性试验。结果该试纸条仅与O157反应,与其他受试菌株均不反应。检测敏感性为106CFU/mL,对人工污染EHEC O157模拟牛肉样品增菌后检测,敏感性为56 CFU/g。结论成功研制出EHEC O157胶体金免疫层析试纸条,敏感性高,特异性强,检测速度快,10min可出结果,操作简便,可用于现场大量样品的检测。     

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）联合荧光定量PCR（real-time PCR）技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。     

一种快速鉴别牛肉中大肠杆菌O157∶H7检测方法的建立及应用

目的 建立一种快速、准确检测牛肉中大肠杆菌O157∶H7的方法。方法 利用抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体2G5(捕获抗体),酶标单克隆抗体2E3(HRP-2E3,检测抗体),建立可用于检测大肠杆菌O157∶H7的双抗体夹心ELISA方法,同时对反应条件进行优化并对该方法进行评价。 结果 通过优化得到最佳反应条件,单克隆抗体2G5最佳包被浓度为4.48 μg/mL,HRP-2E3最佳检测浓度为19.9 μg/mL。该方法对纯培养菌液最低检出限为 1×10⁵ CFU/mL,具有良好的敏感性,且特异性良好,与其他大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等均无交叉反应。板内及板间变异系数均小于7%,具有较高的精密度。人工污染牛肉样品增菌8 h后,对大肠杆菌O157∶H7的检出限为1 CFU/25 g。结论 建立的双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度、准确度、重复性良好,特异性强,可用于临床实际样品检测。     

贵州省首次从腹泻病例中检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 从贵州省1例腹泻病例的粪便标本中分离鉴定O157肠出血性大肠杆菌并对其进行毒力基因检测。方法 收集腹泻病例的粪便标本,mEC肉汤增菌后,采用O157胶体金进行初筛,阳性者增菌液经免疫磁珠富集后进行肠出血性大肠杆菌的分离,对分离株进行系统生化鉴定,O157、H7诊断血清凝集,应用特异性PCR进行rfbE和fliC基因鉴定,以及stx1、stx2、eaeA和hlyA 4种毒力基因检测。结果 腹泻病例粪便标本经mEC肉汤增菌后,检测O157胶体金阳性;增菌液经免疫磁珠富集后培养出可疑菌落,经系统生化鉴定为大肠杆菌,血清型为O157∶H7;PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因均阳性;毒力基因eaeA、stx2和hly均阳性,stx1阴性。结论 分离株确诊为肠出血性大肠杆菌O157∶H7,为贵州省腹泻病例中首株该病原体。     

实时PCR在大肠杆菌O157:H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157：H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157：H7大肠杆菌rfbE基因序列，应用分子生物学软件进行序列比对，在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针，对荧光定量PCR反应条件进行优化，建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157：H7的反应体系，并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157：H7菌株的检测结果均为阳性。而所有其它菌株检测结果均为阴性；该方法检测的灵敏度可达1cfu／μL。重复性检测的变异系数均小于5％。在模拟污染牛奶中，可检出l×10^2 cfu／μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，可用于大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7检测芯片的制备

目的设计和制备快速检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157：H7基因芯片。方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因以及大肠杆菌O157：H7特异的编码菌体抗原rfbE、鞭毛抗原fliC和毒素SLT1、SLT2基因。设计引物和探针，并制备检测芯片，通过两次PCR扩增，制备荧光标记的靶序列，并与芯片进行杂交，检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157：H7。结果所有霍乱弧菌和大肠杆菌O157：H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交，均在芯片相应探针处出现阳性信号。非霍乱弧菌和非O157：H7菌株杂交结果均为阴性。结论基因芯片可以快速检测霍乱弧菌的O157：H7。