犬源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

目的 了解犬源耐药性大肠杆菌的流行情况。方法 采集犬的肛拭子样品191份,进行大肠杆菌的分离鉴定及分群;对分离的大肠杆菌进行氨苄西林、多粘菌素B等13种抗生素药敏检测及耐药谱分析。结果 从样品中分离鉴定出254株大肠杆菌。细菌耐药性检测结果表明,对阿米卡星和氨苄西林的耐药率最高(77.56%,75.98%),对美洛培南和多粘菌素耐药率较低(3.54%,3.94%);其中187株菌表现为对3类以上抗生素的多重耐药表型(73.62%),仅有8株菌对13种药物都敏感(3.15%);宠物犬携带的大肠杆菌耐药率比工作犬更高。结论 研究获得了犬源大肠杆菌耐药性的基本流行病学数据,检测到了对6类12种抗生素耐药的泛耐药菌,首次发现了对包括多粘菌素在内的全部7类抗生素耐药的超广谱耐药犬源大肠杆菌,为深入研究动物源耐药性产生与传播机制以及指导伴侣动物临床用药提供了科学依据。     

肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测方法用于食品样品中肠出血性大肠杆菌O157的快速筛查。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以抗EHEC O157 LPS单克隆抗体标记,以兔抗O157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O157胶体金免疫层析检测试纸条,并进行了特异性和敏感性试验。结果该试纸条仅与O157反应,与其他受试菌株均不反应。检测敏感性为106CFU/mL,对人工污染EHEC O157模拟牛肉样品增菌后检测,敏感性为56 CFU/g。结论成功研制出EHEC O157胶体金免疫层析试纸条,敏感性高,特异性强,检测速度快,10min可出结果,操作简便,可用于现场大量样品的检测。     

猪链球菌2型和9型菌株的多重PCR检测

目的建立一种快速、特异且敏感的检测方法。方法以猪链球菌2型和9型的荚膜多糖抗原编码基因簇中的cps2J和cps9H基因、猪链球菌2型的主要毒力因子编码基因epf和mrp为靶基因设计了四对引物,建立了检测猪链球菌的多重PCR反应体系。用编码cps2J和cps9H基因的引物可对猪链球菌2型和9型进行分型,用编码epf和mrp基因的引物可鉴定猪链球菌2型的主要毒力相关基因。用该多重PCR反应体系对10株猪链球菌分离株进行了鉴定,并以其它几株阴性对照菌株进行对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌2型菌株进行倍比稀释后进行菌落计数,并将之作为模板,对该多重PCR反应体系检测的敏感性进行了鉴定。结果10株猪链球菌分离株中有5株是9型菌株,另有5株是2型菌株,2型菌株有2种基因型:3株cps2+mrp+epf+型,2株cps2+mrp-epf-型。同时还表明该多重PCR反应体系有高度的特异性和敏感性,当模板含量在10cfu时仍能检出目的菌株。结论该多重PCR反体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法。     

布鲁氏菌S2菌壳的安全性和免疫学特性研究

目的利用小鼠模型对布鲁氏菌菌壳、布鲁氏菌S2活菌和福尔马林灭活菌的安全性和免疫学特性进行比较研究。方法利用猪布鲁氏菌S2株和重组裂解质粒制备出布鲁氏菌菌壳,将布鲁氏菌菌壳、布鲁氏菌S2活菌和福尔马林灭活菌通过腹腔注射免疫小鼠,进行安全性比较分析。监测免疫后小鼠的血清抗体水平、脾脏T淋巴细胞分型,并进行免疫攻毒实验。结果与布鲁氏菌弱毒疫苗菌株S2比较,布鲁氏菌菌壳具有更好的安全性,免疫小鼠后能产生与弱毒菌株相似的血清抗体水平、脾CD3+和CD4+T淋巴细胞反应,并具有与之相当的免疫保护作用。结论布鲁氏菌菌壳具有良好的安全性,能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应,可作为预防布鲁氏菌病的新型候选疫苗。     

猪链球菌2型新基因岛SSGI4的发现

目的通过比较猪链球菌2型强毒株与弱毒株和无毒株的基因组差异,发现新的基因岛,探讨猪链球菌的基因群水平转移及其与致病性之间的关系。方法在已知猪链球菌2型强毒株全基因组序列和对可能基因岛的分析基础上,通过DNA测序和生物信息学分析,对基因岛的结构进行分析鉴定,并预测其功能。结果发现了一个只存在于猪链球菌2型中国强毒株,而在弱毒株和无毒株中整体缺失的新基因岛,命名为SSGI4。基因岛全长11 269bp,G+C含量(36.8%)明显低于基因组总G+C含量(41.1%),基因岛两端均有10bp的正向重复序列,并且末端携带有噬菌体整合酶基因,显示很可能是通过溶原性噬菌体整合入基因组。基因岛包含11个编码基因,部分基因推测为可能的膜表面蛋白基因或氨基酸结合蛋白基因。结论新发现的基因岛SSGI4具有致病性基因岛的各项典型特征,可能与猪链球菌2型强毒株的致病性有关,具有深入研究的价值。     

肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7表面抗原的特异性单克隆抗体,以期用于该病原菌的检测。方法以敲除毒力基因的O157突变株F25全菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,分别以全菌抗原和热酚水法纯化的O157 LPS抗原用间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果建立了稳定分泌抗O157 LPS抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6,分泌抗体属IgG3亚类,轻链为κ型。腹水抗体ELISA效价达1∶3.2×106。以辛酸/饱和硫酸铵法纯化后抗体效价为1∶1.6×106,亲和常数Ka大于6.14×10-11mol/L。用于协同凝集和间接荧光抗体试验具有良好的特异性。结论该单克隆抗体针对O157的LPS抗原,特异性强,亲和力高,可用于O157的检测或分离鉴定。     

致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

目的 了解长春地区水产品中致病性嗜水气单胞菌流行菌株的分布及其耐药情况。方法 采用国标方法 初步分离嗜水气单胞菌,结合生化及分子生物学方法进行种属鉴定并检测毒力基因,测定致病株毒力及耐药谱。结果 319份样品中共分离到279株嗜水气单胞菌,分离率87.46%。毒力基因阳性株为24株,阳性率为8.60%,毒力基因阳性株全部为β-溶血并具有较强的细胞毒性。致病性分离株至少耐受4类抗生素,均为多重耐药株。结论 研究获得了长春地区嗜水气单胞菌的基本流行病学数据,探讨了其毒力谱和多重耐药模式,为嗜水气单胞菌病防控措施提供了依据。     

布鲁氏菌S2株菌壳的制备研究

目的 利用温控表达调节系统在布鲁氏菌中诱导表达裂解基因E,制备布鲁氏菌S2株菌壳,监测其裂解效率,并观察菌壳形态。方法 从pBV220::E中PCR扩增温控裂解盒和裂解基因E融合片段,克隆至pBBR1MCS-2载体上,构建重组裂解质粒pBBR1MCS-E,并将其电转化至布鲁氏菌S2株,构建重组菌S2(pBBR1MCS-E)。通过28℃至42℃升温诱导培养制备布鲁氏菌菌壳,绘制生长曲线和裂解曲线,计算裂解率,并电镜观察菌壳形态。结果 成功构建了重组裂解质粒pBBR1MCS-E并制备了布鲁氏菌菌壳。绘制出了布鲁氏菌裂解曲线,布鲁氏菌菌壳的裂解率达99.99%,经高渗溶液冻融后可完全消除其中残存的活菌。电镜观察表明布鲁氏菌菌壳保持有细胞的基本形态,但由于细胞内容物外流而使细胞发生变形和皱缩。结论 本研究成功制备出了布鲁氏菌菌壳,为进一步研究布鲁氏菌菌壳的特性奠定了基础。     

野生水鸟感染霍乱弧菌和沙门菌等病原菌的分离和鉴定

目的 从死亡的野生水鸟标本中分离、鉴定病原菌,评估迁徙鸟类传播人兽共患病原菌的风险。方法 采集的组织标本涂布营养琼脂平板,分别在需氧和厌氧的条件下培养。分离的菌株使用Phoenix100全自动微生物鉴定仪和16s rRNA测序的方法鉴定细菌种属,随后通过PCR的方法检测病原菌携带主要毒力基因的情况。结果 从骨顶鸡、鸬鹚和红嘴鸥等鸟类的组织标本中分离鉴定出霍乱弧菌、沙门菌和产气荚膜梭菌等多种肠道感染相关的病原细菌。霍乱弧菌经PCR鉴定不属于O1和O139血清群,无霍乱毒素和毒素相关菌毛的编码基因,但是有溶血素的编码基因。结论 检测的死亡鸟类个体存在多病原细菌的感染。