内源性sestrin2参与抑制心肌梗死后内质网应激所诱导细胞凋亡

目的 探讨sestrin2在心梗（MI）后内质网应激中的变化及作用。 方法 结扎大鼠前降支制作MI模型建立MI组,仅开胸建立Sham组;应用衣霉素刺激新生大鼠心肌细胞建立细胞内质网应激模型（衣霉素组）应用磷酸盐缓冲溶液（PBS）为对照组。原位切口末端标记法（TUNEL）评估组织水平细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率。蛋白免疫印迹法检测葡萄糖调节蛋白（GRP）78、CCAAT-增强子结合蛋白（CHOP）、sestrin2表达水平。 结果 与Sham组相比,MI大鼠心脏组织中内质网应激激活,GRP 78及CHOP表达水平增加（均P < 0.01）,心肌细胞凋亡增加（P < 0.01）,伴随内源性sestrin2蛋白表达水平上调（P < 0.01）。与对照组相比,衣霉素刺激新生大鼠心肌细胞激活内质网应激,GRP 78及CHOP蛋白表达水平增加（P < 0.01,P < 0.05）,心肌细胞凋亡表型增加（P < 0.01）。在此基础上,转染sestrin2-siRNA抑制心肌细胞sestrin2表达后,CHOP蛋白表达上调（P < 0.05）,心肌细胞凋亡增加（P < 0.05）。 结论 内源性sestrin2参与抑制心肌缺血后内质网应激诱导心肌细胞凋亡。     

脂质运载蛋白2促进胶原沉积和炎症反应参与川崎病导致心肌损伤的实验研究

目的 探讨脂质运载蛋白（Lcn）2在川崎病(KD)时心肌损伤的作用和相关机制。 方法 将40只（1月龄）SD大鼠随机分为对照组和干酪乳杆菌细胞壁成分（LCWE）模型组。建立KD大鼠模型4周后酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法检测KD大鼠血浆和心肌组织匀浆中Lcn 2的含量；心脏超声检测大鼠心脏收缩舒张功能；Masson染色评估心肌胶原产生的程度；荧光实时定量PCR法检测心肌组织中白介素（IL）-6、CD3、CD45和胶原蛋白（Collagen）I的mRNA表达；Western blot方法检测心肌组织中核因子（NF）-кB和其抑制蛋白IкB的磷酸化水平和Collagen I的蛋白表达变化。采用IкB的抑制剂BAY 11-7082（2.5 μmol/L）处理可有效抑制Collagen I的表达。 结果 LCWE注射28 d后，成功诱导KD大鼠冠状动脉损伤（P<0.05）。在此基础上发现，KD大鼠心脏左室舒张末期内径（LVIDd）增加，左室射血分数（LVEF）降低（P<0.05）。Masson染色显示KD大鼠心肌出现一定程度心肌纤维化和胶原沉积。心肌中的IL-6、CD3和CD45等炎症相关分子的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。KD大鼠心脏组织和循环中Lcn 2水平升高（P<0.05）。给予心肌成纤维细胞Lcn 2（10 ng/ml）处理48 h，心肌成纤维细胞Collagen I 的mRNA和蛋白表达水平均升高（P<0.05）。并且Lcn 2处理可显著上调心肌成纤维细胞NF-кB和IкB的磷酸化水平。采用IкB的抑制剂BAY 11-7082（2.5 μmol/L）处理可有效抑制Lcn 2对Collagen I蛋白的上调作用。 结论 KD状态下Lcn 2显著升高，Lcn 2通过激活NF-кB信号途径诱发心肌成纤维细胞胶原合成增加和产生炎症反应，进而造成心肌损伤。     

PDE5抑制剂对异丙肾上腺素诱导乳鼠心肌细胞肥大的作用

目的 探讨磷酸二酯酶5（PDE5）抑制剂对异丙肾上腺素（Iso）所致的乳鼠心肌细胞肥大的保护作用。 方法 分离大鼠乳鼠心肌细胞,分为对照（Con）组,Iso组及异丙肾上腺素+西地那非（Iso+Sil）组,通过检测各组细胞活力及乳酸脱氢酶（LDH）含量,确定Sil的后续实验浓度,通过RT-PCR检测心肌肥大指标心房钠尿肽(ANP)和β-肌球蛋白重链(β-MHC) mRNA含量、流式细胞计数检测凋亡情况及Western blot检测内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）水平。 结果 与Con组相比,Iso组细胞活力降低（P<0.01）,LDH的释放增加（P<0.05）。与Iso组相比,一定浓度Sil预处理可以提高细胞活力及减少LDH的释放（P<0.05）,在5 μmol/L Sil预处理时达到最大效应。与Con组相比,Iso组增加ANP和β-MHC mRNA的表达、上调凋亡比率以及增加GRP78和CHOP的蛋白水平。与Iso组相比,Sil预处理可以降低ANP和β-MHC mRNA的表达,下调凋亡比率以及抑制GRP78和CHOP的蛋白表达。 结论 PDE5抑制剂Sil可以有效抑制Iso诱导的乳鼠心肌细胞肥大,其机制可能与凋亡和内质网应激的下调有关。     

消癌解毒方通过内质网应激诱导肝癌HepG2细胞凋亡的研究

[目的]探讨内质网应激在消癌解毒方在人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用。[方法]CCK-8法检测不同浓度的消癌解毒方处理HepG2细胞12、24、48 h后细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测细胞消癌解毒方处理HepG2细胞24 h凋亡情况;应用qRT-PCR检测内质网应激上游分子标记GRP78、PERK、ATF-6、IRE-1的mRNA水平;采用Western blot方法分析消癌解毒方对PERK、ATF4、CHOP和TRB3蛋白的表达情况;并用CCK-8法检测内质网抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)对HepG2细胞凋亡率的影响。[结果]消癌解毒方抑制HepG2细胞的增殖,并且这种效应呈现时间和浓度依赖;ATF-6和IRE-1 mRNA水平无明显变化,GRP78和PERK mRNA水平较阴性对照组均显著增加;消癌解毒方可上调内质网应激通路的标志蛋白质PERK、ATF4、CHOP水平,增加下游TRB3蛋白的表达。4-PBA与消癌解毒方联合作用组的细胞凋亡率显著减少。[结论]消癌解毒方通过内质网应激诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,其可能是通过PERK通路上调内质网应激相关凋亡蛋白CHOP的表达。     

Ghrelin通过抑制ERS减轻ISO所致的心肌损伤和心肌细胞凋亡

目的探讨ghrelin（G）减轻异丙基肾上腺素（isoproterenol,ISO）所致心肌损伤和凋亡是否与其抑制心肌内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）有关。方法：将29只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为对照（Con）组、ISO组和ISO＋G组。Con组皮下注射生理盐水,ISO组皮下注射ISO,ISO＋G组皮下注射ISO前2 d皮下注射ghrelin。采用生理记录仪测定各组大鼠心功能。以HE染色及血浆乳酸脱氢酶（LDH）及肌酸激酶MB（CK-MB）活性的测定评估心肌损伤的程度。用TUNEL法测定心肌细胞的凋亡。用Western blot检测各组心肌组织中ERS标志性分子C／EBP同源蛋白（C／EBP-homologous protein,CHOP）和easpase．12的表达。结果：外源性ghrelin可显著缓解ISO所致大鼠的心功能不全,减轻ISO造成的心肌损伤,减少心肌细胞凋亡,并降低CHOP和剪切的caspase-12的表达。结论：ghrelin通过抑制ERS可减轻ISO所致心肌损伤和心肌细胞凋亡。     

烟酰胺核糖抑制1型糖尿病大鼠心肌线粒体分裂的作用及机制

目的 探讨烟酰胺核糖（nicotinamide riboside, NR）对1型糖尿病（DM）大鼠心肌线粒体融合分裂的作用及其机制。 方法 利用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导1型DM大鼠模型,随机分为4组:正常对照（Con）组,Con+NR组,DM组,DM+NR组。监测大鼠血糖和体质量变化,葡萄糖耐量试验（IPGTT）检测糖代谢情况,采用小动物超声评估大鼠心脏功能变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,DHE染色检测心肌细胞ROS含量,透射电镜观察线粒体形态,Western blot法检测线粒体分裂、融合相关蛋白表达水平。 结果 与Con组相比,DM组大鼠的血糖、血脂明显升高,体质量减轻,心脏左室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室短轴缩短率（Left ventricular fractional shortening, LVFS）减低,心肌细胞凋亡增加,氧化应激增强,线粒体分裂增多,线粒体融合蛋白Opa1表达下调（P<0.05, P<0.01）;与DM组相比,DM+NR组大鼠心脏LVEF改善,心肌细胞凋亡减少,氧化应激减少,线粒体融合增加,线粒体融合蛋白Opa1和Mfn2表达上调（P<0.05）。 结论 NR可增加DM心肌融合蛋白Opa1与Mfn2的表达,抑制DM心肌线粒体分裂,降低DM心肌凋亡和氧化应激,改善心脏功能。     

核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号在川崎病诱发心肌损伤中的作用

目的 探讨核因子E2相关因子（Nrf）2/血红素加氧酶（HO）-1信号通路在川崎病（KD）诱发心肌损伤中的作用。 方法 60只4周龄SD大鼠随机分为对照组、干酪乳杆菌细胞壁成分（LCWE）模拟川崎病组（KD）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）干预KD组（KD+TBHQ），每组20只；对照组腹腔注射生理盐水0.5 ml，KD组和KD+TBHQ组腹腔注射LCWE 0.5 ml（1 mg/ml）。4周后，小动物超声检测大鼠心脏功能，酶联免疫吸附法（ELISA）检测心肌组织内丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和Caspase-3的活性，Western blot检测心肌组织内Nrf2和HO-1以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。 结果 注射LCWE 4周后，成功制备KD模型鼠。同时发现，与对照组相比，KD组左室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）均明显降低（P < 0.05），心肌组织凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax比值显著降低（P < 0.05），Caspase-3活性明显升高（P < 0.05），心肌组织中MDA含量增加，而SOD活性降低（P < 0.05），Nrf2和HO-1蛋白表达显著降低（P < 0.05）；而应用Nrf2激动剂TBHQ后，可显著改善KD引起的心肌损伤，并且明显降低心肌组织氧化应激程度（P < 0.05）。 结论 KD抑制心肌中Nrf2/HO-1信号，导致氧化应激程度增强，引起细胞凋亡增加，进而引发心脏损伤，TBHQ激活Nrf2可明显改善KD的上述作用。     

钙通道阻滞剂改善内质网应激抑制压力过负荷高血压大鼠的心肌重构

目的:研究在压力过负荷应激状态下钙通道阻滞剂拉西地平对内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）分子钙网蛋白（calreticulin,CRT）和细胞凋亡效应分子-12(caspase-12)在大鼠心肌组织中的表达及对心肌重构的影响。方法: 将30只雄性Sprague-Dawly(SD)大鼠随机分为3组,即假手术组(Sham组)、腹主动脉缩窄组（TAC组）及TAC＋拉西地平干预组（简称拉西地平组）,每组10只。通过颈动脉插管测定各组大鼠的血流动力学,心脏超声心动图检查左心室的形态结构。采用免疫组化染色法检测大鼠心肌中CRT及caspase-12蛋白的表达水平,TUNEL荧光染色法检测心肌细胞的凋亡率。结果: 与Sham组相比较,TAC组大鼠的平均动脉压(MAP)、室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室质量指数(LVWI)、CRT和caspase-12蛋白表达水平及心肌细胞的凋亡率比较,均有显著升高(P<0.01)。拉西地平组大鼠MAP、IVST、LVPWT、LVWI、CRT和caspase-12蛋白的表达水平及心肌细胞的凋亡率较TAC组明显下降(P<0.05)。结论: 内质网应激可能参与了压力过负荷高血压大鼠心肌重构的过程。钙通道阻滞剂拉西地平可能通过降低CRT及caspase-12的表达及减少心肌细胞的凋亡干预ERS介导的压力负荷所致高血压大鼠心肌肥厚的信号通路,从而通过改善内质网应激发挥对心脏的保护作用。     

钠尿肽嵌合体CNAAC抗大鼠缺血/再灌注心肌损伤的作用

目的 探讨钠尿肽嵌合体C_NAA_C在抗缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）心肌损伤中的作用及可能机制。 方法 将SD大鼠随机分为三组,即假手术组（Sham组）、缺血/再灌注组（I/R组）、缺血/再灌注+C_NAA_C组（I/R+C_NAA_C组）,缺血30 min,再灌注120 min。再灌注结束后观察并检测各组大鼠心肌组织结构、心肌细胞超微结构、心肌细胞凋亡、体液因子和相关蛋白表达的变化。 结果 与Sham组相比,I/R组大鼠心肌细胞出现肿胀、炎性浸润,心肌线粒体分裂增加,细胞色素C的表达、心肌细胞凋亡增多（P<0.01）,心肌梗死面积、血清LDH、CK-MB和cTnT的水平显著增加（P<0.01）,心肌PI3K、磷酸化Akt（Ser473）表达显著减少（P<0.01）;与I/R组相比,I/R+C_NAA_C组大鼠心肌细胞炎性浸润减少、心肌排列整齐,心肌线粒体分裂被抑制,细胞色素C的表达、心肌细胞凋亡减少（P<0.01）,心肌梗死面积降低（P<0.01）,血清中LDH、CK-MB、cTnT的水平下降（P<0.01）,心肌PI3K、磷酸化Akt的表达显著增加（P<0.01）。 结论 C_NAA_C具有上调PI3K/Akt信号通路以及明显改善心肌缺血/再灌注大鼠心肌损伤的作用。     

血管紧张素Ⅱ激活内质网应激促进大鼠血管平滑肌细胞凋亡的研究

目的:探讨内质网应激(ERS)在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡中的作用。方法:Ang Ⅱ诱导大鼠VSMC凋亡模型,并应用ERS抑制剂干预,采用流式细胞仪检测VSMC凋亡率;Western Blot检测ERS相关凋亡因子的表达变化。结果:不同浓度Ang Ⅱ(1、10、50μM)均可诱导VSMC凋亡,其总凋亡率(23.1±5.5)%、(30.0±2.5)%、(55.4±3.3)%与对照组(10.9±2.5)%相比显著升高(P0.05);Ang Ⅱ可诱导大鼠VSMC细胞ERS相关凋亡因子表达升高,与对照组相比,CHOP及Caspase12水平分别升高3.15倍和2.35倍(P0.05);与Ang Ⅱ刺激组相比,应用PERK通路抑制剂可显著降低Ang Ⅱ诱导的CHOP和Caspase12表达水平(P0.05),并降低Ang Ⅱ诱导的总凋亡率((14.6±2.7)%,P0.05)。结论:Ang Ⅱ可通过激活内质网应激CHOP和Caspase12通路诱导大鼠VSMC凋亡。     

白藜芦醇激活Sirt1/Nrf2信号减轻川崎病诱发的心肌损伤

目的 探讨白藜芦醇在川崎病（KD）诱发心肌损伤中的作用及对Sirt1/Nrf2信号通路的调控。 方法 60只4周龄SD大鼠随机分为对照（Control）组、干酪乳杆菌细胞壁成分（LCWE）模拟川崎病（KD）组、白藜芦醇干预KD（KD + Res）组和白藜芦醇联合Sirt1抑制剂EX527干预KD（KD+Res+EX527）组,对照组腹腔注射生理盐水0.5 ml,其余各组腹腔注射LCWE 0.5 ml（1 mg/ml）,此外,KD+Res组腹腔注射Res（100 mg/kg）,KD+Res+EX527组腹腔注射Res（100 mg/kg）和EX527（5 mg/kg）。4周后,小动物超声检测大鼠心脏功能,酶联免疫吸附法（ELISA）检测心肌组织内丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和Caspase-3的活性,Western blot检测心肌组织内沉默信息调节因子（Sirt）1、核因子E2相关因子（Nrf）2和血红素加氧酶（HO）-1以及凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的蛋白表达水平。 结果 与对照组相比,KD组左室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）均明显降低（P < 0.05）,心肌组织凋亡相关蛋白Bcl2与Bax比值显著降低（P < 0.05）,Caspase-3活性明显升高（P < 0.05）,心肌组织中MDA含量增加,而SOD活性降低（P < 0.05）,Sirt1、Nrf2和HO-1蛋白表达均显著降低（P < 0.05）;而应用Res后,可显著改善KD引起的心肌损伤,明显降低心肌组织氧化应激程度（P < 0.05）,并伴有Sirt1、Nrf2和HO-1蛋白表达的升高（P < 0.05）。而Sirt1抑制剂EX527可阻断白藜芦醇的保护作用。 结论 KD引起的心肌损伤中Sirt1/Nrf2信号通路抑制,氧化应激增强;而Res可通过激活Sirt1/Nrf2信号减轻氧化应激改善KD引起的心肌损伤。     

脂联素依赖p38-MAPK途径抑制衣霉素诱导的内质网应激致心肌细胞凋亡

目的通过原代培养SD大鼠的乳鼠心肌细胞建立衣霉素心肌细胞内质网应激损伤模型,观察脂联素对心肌细胞内质网应激致细胞凋亡的作用及其机制。方法采用酶消化法原代培养乳鼠心肌细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长,通过α-肌动蛋白免疫荧光法对培养的心肌细胞进行鉴定。选用原代培养3～4天的心肌细胞,随机分为五组:对照组、1 mg/L衣霉素组、1 mg/L衣霉素+100 mg/L脂联素组、1 mg/L衣霉素+3μmol/LSB203580组及1 mg/L衣霉素+3μmol/L SB203580+100 mg/L脂联素组。实验终止后,在倒置相差显微镜下观察心肌细胞形态变化,通过流式细胞术检测心肌细胞凋亡,用qRT-PCR及免疫荧光法检测内质网应激指标GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达。结果与对照组相比,给予衣霉素后,细胞凋亡率显著增加,GRP78和CHOP的mR-NA及蛋白表达增加。脂联素预处理后给予衣霉素,可较大程度地逆转上述指标变化,细胞凋亡率显著下降,GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达减少;而加用p38-MAPK抑制剂SB203580后脂联素的保护作用明显减弱,凋亡率显著增加,GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达增高,但较单纯衣霉素处理组凋亡率低,GRP78和CHOP的mRNA及蛋白表达也减少。结论衣霉素可使GRP78和CHOP表达增强,启动内质网应激,导致心肌细胞凋亡,脂联素可以通过减轻内质网应激逆转衣霉素所致的心肌细胞凋亡作用,对心肌细胞有保护作用,且这种保护作用部分是通过p38-MAPK途径实现的。     

番茄红素减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧致内质网应激的相关机制

目的 探讨番茄红素减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)致内质网应激(ERS)的相关机制。方法 H9C2心肌细胞随机分为:①空白对照组、②番茄红素组、③H/R组、④番茄红素+H/R组、⑤4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid,4-PBA）+H/R组、⑥毒胡萝卜素内酯（thapsigargin,TG）组、⑦番茄红素+TG组。流式细胞术检测H9C2心肌细胞凋亡比例;Western blot检测葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated proteins,GRP)78、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal protein kinase,JNK)、磷酸化JNK（p-JNK）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Casepase)-12的表达。结果 与对照组相比,H/R组及TG组细胞的细胞凋亡比例、GRP78、CHOP、p-JNK和Caspase-12蛋白表达量明显增加（P<0.01）;与H/R组相比,细胞凋亡比例及上述蛋白表达在番茄红素+H/R组与4-PBA+H/R组明显下降（P<0.01）;与TG组相比,细胞凋亡比例及上述蛋白表达在番茄红素+TG组也明显下降（P<0.01）;而番茄红素+H/R组与4-PBA+H/R组相比差异不具有统计学意义。JNK蛋白总量表达无明显变化。结论 番茄红素通过抑制ERS致凋亡的相关信号通路CHOP、p-JNK和Caspase-12对H/R H9C2心肌细胞起到保护作用。     

谷氨酰胺对模拟失重大鼠心脏氧化应激的影响

目的 探讨谷氨酰胺（Gln）对模拟失重大鼠心脏氧化应激的影响。 方法 利用尾部悬吊方法建立大鼠模拟失重模型,将18只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为3组:对照（Control）组、尾部悬吊（HU）组和尾部悬吊+Gln干预（HU + Gln）组。尾吊4周后,超声检测大鼠心脏功能,免疫荧光法检测心肌组织内二氢乙锭（DHE）标记的超氧阴离子含量,试剂盒测定心肌组织中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢（H₂O₂）的含量。分离原代乳鼠心肌细胞和成年大鼠心肌细胞,均分为以下4组:对照（Control）组,Gln干预（Gln）组,H₂O₂处理（H₂O₂）组和H₂O₂处理+Gln干预（H₂O₂ + Gln）组。采用流式细胞术检测乳鼠心肌细胞的凋亡。检测成年大鼠心肌细胞中MDA和GSH含量,并通过对心肌细胞内Ca2+进行fluo-4染色,在共聚焦显微镜下对心肌细胞的收缩功能进行测量。 结果 与Control组相比,HU组心肌组织中DHE染色荧光强度、MDA和H₂O₂含量显著增加（P均<0.01）,GSH含量显著降低（P <0.01）,提示HU可导致心肌组织氧化应激增强;而Gln干预可降低HU大鼠心肌组织中DHE染色荧光强度、MDA和H₂O₂含量（P均<0.05）,并增加GSH含量（P <0.05）。HU组大鼠的左室射血分数（EF）、缩短分数（FS）和心排出量（CO）均显著低于Control组（P均<0.05）,而Gln干预可使HU大鼠心脏EF、FS和CO显著增加（P 均<0.05）。对于原代培养的乳鼠心肌细胞,给予Gln可显著抑制H₂O₂所致的心肌细胞凋亡（P <0.01）。对于成年大鼠心肌细胞,给予Gln可减轻H₂O₂处理所致的心肌细胞氧化应激（P <0.05）,并且增强H₂O₂处理降低的心肌细胞缩短幅值（P <0.01）和Ca2+瞬变幅度（P <0.05）。 结论 Gln通过减轻模拟失重大鼠心脏的氧化应激损伤改善心脏功能,其机制可能与促进心肌细胞GSH合成有关。