顺铂诱导肝癌细胞凋亡过程中的Survivin表达变化及意义

目的：研究顺铂体外对肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的影响。方法：培养人肝癌细胞株HepG2,加入2μg/ml的顺铂,对照组和加药后24h、48h分别以PT-PCR和免疫印迹技术检测Survivin mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。结果：顺铂体外对肝癌HepG2细胞作用后,对照组和加药后24h和48h的细胞凋亡率分别是（1.74±0.36）%,（9.38±1.10）%,（16.87±2.26）%;其Survivin mRNA则分别比对照组提高了1.3倍和2.8倍;蛋白分别提高了1.2倍和3.5倍。结论：顺铂可促使肝癌细胞内Survivin的表达上调,抵抗其诱导的细胞凋亡。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2凋亡及其PEG10基因表达的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人肝癌细胞系HepG2凋亡及其PEG10基因表达调控的影响,进一步探讨肝癌的发病机制及5-Aza-CdR治疗肝癌的可行性。方法用浓度为50 μmol/L的5-Aza-CdR分别处理HepG2细胞24、48、72 h,hoechst 33342/PI 双染荧光显微镜检测HepG2细胞凋亡情况。RT-PCR、Western blot法分别检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,5-Aza-CdR作用24、48、72 h后,HepG2细胞的凋亡率明显升高,PEG10 mRNA 和蛋白表达水平显著下降,并呈现时间依赖性（P＜0.05）。结论5-Aza-CdR 可促进HepG2细胞凋亡并抑制PEG10基因的表达。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2凋亡及其PEG10基因表达的影响

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肝癌细胞系HepG2凋亡及其PEG10基因表达调控的影响,进一步探讨肝癌的发病机制及5-Aza-CdR治疗肝癌的可行性.方法 用浓度为50 μmol/L的5-Aza-CdR分别处理HepG2细胞24、48、72 h,hoechst 33342/PI双染荧光显微镜检测HepG2细胞凋亡情况.RT-PCR、Western blot法分别检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 与对照组相比,5-Aza-CdR作用24、48、72 h后,HepG2细胞的凋亡率明显升高,PEG10 mRNA和蛋白表达水平显著下降,并呈现时间依赖性(P＜0.05).结论 5-Aza-CdR可促进HepG2细胞凋亡并抑制PEG10基因的表达.     

阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究

 目的　了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制。方法　用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞。应用 RT-PCR和Western blotting的方法检测各组细胞Survivin基因 的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况。结果　K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h 后,细胞的Survivin mRNA 表达较加药前分别增加1.92、3.38倍（P＜0.05）;24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍（P＜0.05）。结论　阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin 基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应。化疗药物作用后Survivin 基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制。     

阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究

目的 了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制.方法 用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞.应用RT-PCR和Western blotting的方法 检测各组细胞Survivin基因的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况.结果 K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h后,细胞的Survivin mRNA表达较加药前分别增加1.92、3.38倍(P<0.05);24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍(P<0.05).结论 阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应.化疗药物作用后Survivin基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制.     

阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究

目的 了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制.方法 用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞.应用RT-PCR和Western blotting的方法 检测各组细胞Survivin基因的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况.结果 K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h后,细胞的Survivin mRNA表达较加药前分别增加1.92、3.38倍(P<0.05);24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍(P<0.05).结论 阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应.化疗药物作用后Survivin基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制.     

阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究

目的 了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制.方法 用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞.应用RT-PCR和Western blotting的方法 检测各组细胞Survivin基因的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况.结果 K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h后,细胞的Survivin mRNA表达较加药前分别增加1.92、3.38倍(P<0.05);24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍(P<0.05).结论 阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应.化疗药物作用后Survivin基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制.     

阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究

目的 了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制.方法 用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞.应用RT-PCR和Western blotting的方法 检测各组细胞Survivin基因的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况.结果 K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h后,细胞的Survivin mRNA表达较加药前分别增加1.92、3.38倍(P<0.05);24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍(P<0.05).结论 阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应.化疗药物作用后Survivin基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制.     

阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究

目的 了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制.方法 用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞.应用RT-PCR和Western blotting的方法 检测各组细胞Survivin基因的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况.结果 K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h后,细胞的Survivin mRNA表达较加药前分别增加1.92、3.38倍(P<0.05);24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍(P<0.05).结论 阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应.化疗药物作用后Survivin基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制.     

阿糖胞苷对白血病细胞K562凋亡抑制基因Survivin的作用研究

目的 了解人类白血病细胞在化疗药物阿糖胞苷作用下的Survivin凋亡抑制基因表达情况,探讨阿糖胞苷治疗耐药的可能机制.方法 用MTT比色法检测K562细胞对阿糖胞苷的敏感性,以阿糖胞苷的IC50药物浓度处理K562细胞.应用RT-PCR和Western blotting的方法 检测各组细胞Survivin基因的mRNA表达情况和蛋白质的表达情况.结果 K562细胞经阿糖胞苷作用24、48 h后,细胞的Survivin mRNA表达较加药前分别增加1.92、3.38倍(P<0.05);24、48 h阿糖胞苷作用组细胞的Survivin的蛋白表达较对照组分别增加1.92、2.64倍(P<0.05).结论 阿糖胞苷作用白血病细胞后,细胞的Survivin基因mRNA和蛋白质表达升高,且具有时间效应.化疗药物作用后Survivin基因表达升高可能是白血病细胞治疗耐药的又一机制.     

沉默AFP基因可抑制肝癌HepG2细胞Survivin mRNA的表达

  目的  探讨肝癌HepG2细胞AFP基因沉默对Survivin表达的影响。  方法  通过siRNA技术下调肝癌HepG2细胞中AFP的表达,采用ELISA法测定转染前后上清液AFP浓度,MTT法检测转染前后细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞凋亡率,RT-PCR检测转染前后细胞Survivin mRNA水平。  结果  转染48 h后,实验组上清液中AFP浓度显著下降,肝癌细胞生长活性下降43.1%,凋亡率增加24.3%,HepG2细胞中Survivin mRNA表达降低78.0%。对照组和空白组的上述指标均无明显变化。  结论  沉默肝癌HepG2细胞AFP的表达,能有效抑制肝癌细胞生长、促进细胞凋亡,这一作用可能与细胞内Survivin mRNA水平降低有关。      

顺铂联合迷迭香酸抑制Huh7细胞增殖诱导凋亡

目的:探讨含铂抗癌药物顺铂（Cisplatin,CDDP）联合中药单体迷迭香酸（Rosmarinic acid,RA）对人原发性肝癌Huh7细胞系增殖与凋亡的影响。方法:通过CCK-8细胞增殖实验检测并计算CDDP和RA治疗24 h、48 h、72 h后的IC50值,随后设置未经药物处理组（control组）、5 μg/mL CDDP处理组、200 μg/mL RA处理组以及5 μg/mL CDDP联合200 μg/mL RA处理组。采用流式细胞术检测control组、CDDP处理组、RA处理组以及联合用药组的细胞凋亡率分别为（7.28±0.56）%、（18.23±2.53）%、（26.44±1.99）%和（37.27±0.28）%。最后,利用免疫印迹试验(Western blot)检测Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3以及Procaspase-3凋亡相关蛋白的表达水平。结果:RA可增强CDDP对Huh7细胞增殖的抑制能力并呈现出浓度依赖性（P＜0.05）,在CDDP联合RA处理组中Huh7细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05）,CDDP联合RA作用后促凋亡蛋白Bax与Cleaved-caspase-3的表达水平增加,而Bcl-2的表达水平下降（P＜0.05）。结论:RA能抑制Huh7细胞增殖并且诱导细胞凋亡,与顺铂联用具有协同作用,其机制可能与激活线粒体凋亡通路有关。     

TBX15基因启动子甲基化在肝细胞癌中的表达及其功能研究

目的  探讨TBX15基因在肝细胞癌中的表达及其启动子甲基化对细胞生物学行为的影响。方法 分别采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）和实时荧光定量PCR（qPCR）检测3种肝癌细胞系（HepG2、MHCC97H、SNU449）中TBX15基因启动子甲基化状态和表达水平,再将空白质粒、空载质粒pc3.1和TBX15过表达质粒转染肝癌ＳＮＵ499细胞,通过CCK-8实验和流式细胞术检测各组肝癌细胞的增殖和凋亡情况。 结果 3种肝癌细胞系中,TBX15基因在肝癌 SNU449细胞中的启动子甲基化程度最高,甲基化率为89.5%,而TBX15 mRNA表达水平最低。TBX15过表达质粒组培养48 h后,肝癌SNU449细胞的增殖能力高于空载质粒组,差异有统计学意义（0.549±0.080 vs 0.457±0.506,P=0.015）;TBX15过表达质粒组肝癌SNU449细胞的总凋亡比例高于空白质粒组,差异有统计学意义［（5.12±1.42）% vs （2.16±0.41）%,P=0.014］。 结论 启动子区异常甲基化可能是肝癌细胞TBX15基因失活的主要原因,且与肝癌恶性生物学行为密切相关。TBX15可能是预测肝癌发生发展的指标。     

Impact of Co-transfection with Livin and Survivin shRNA Expression Vectors on Biological Behavior of HepG2 Cells

Objective: To construct short hairpin RNA (shRNA) eukaryotic expression vectors targeting Livin andSurvivin genes, and to explore the impact of co-transfection of Livin and Survivin shRNA expression vectors onthe biological behavior of HepG2 cells. Methods: shRNA eukaryotic expression vectors pSD11-Livin and pSD11-Survivin were designed and constructed then transfected into HepG2 cells separately or in combination. mRNAand protein expression in transfected cells was assessed by quantitative fluorescence PCR and Western blotting,respectively. Cell proliferation was measured by MTT assay and cell apoptosis by TUNEL assay. Results: TheLivin and Survivin shRNA eukaryotic expression vectors were successfully constructed and transfected intoHepG2 cells. The relative mRNA expression levels of Livin and Survivin in HepG2 cells co-transfected withpSD11-Livin and pSD11-Survivin were 0.12 ± 0.02 and 0.33 ±0.13, respectively, which was significantly lower thanlevels in cells transfected with either pSD11-Livin or pSD11-Survivin (P<0.05). The relative protein expressionlevels of Livin and Survivin in the co-transfected cells were also significantly decreased compared to singletransfection(P<0.05). The inhibition rate of cell growth in the co-transfection group was higher than that in thesingle-transfection groups at 48 h, 60 h, or 72 h after transfection (P<0.01). The apoptotic rate increased to thegreatest extent in the co-transfection group relative to any other group (P<0.05). Conclusions: Co-transfectionwith pSD11-Livin and pSD11-Survivin was more efficient than transfection with either vector alone in reducingthe mRNA and protein expression of Livin and Survivin genes in HepG2 cells. Co-transfection also inhibited theproliferation of transfected cells more than the other groups, and induced cellular apoptosis more effectively.     

狼毒大戟对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡影响及其机制的初步探讨

目的:观察中药狼毒大戟提取液对体外培养的Lewis肺癌细胞凋亡及Caspase-9基因表达的影响。方法:Lewis细胞培养后以不同药物浓度(0.2、0.4和0.8mg/mL)干预24h。Annexin-ⅤFITC/PI双染法检测细胞凋亡率的变化,流式细胞术检测细胞周期的变化;Real-time PCR检测基因Caspase-9表达的变化。结果:阴性对照组与狼毒大戟低、中、高剂量组(0.2、0.4和0.8mg/mL)细胞凋亡率分别为(0.331±0.012)%、(8.27±0.067)%、(28.19±0.270)%和(32.96±0.14)%;阴性对照组与狼毒大戟低中高剂量组S期所占比例分别为(50.3±0.77)%、(44.2±1.82)%、(34.1±1.56)%和(25±0.72)%;Real-time PCR结果显示,阴性对照组与狼毒大戟组Caspase-9mRNA的相对表达量分别为1.00和1.64。结论:狼毒大戟可以明显促进Lewis肺癌细胞的凋亡,将细胞周期阻滞在G0/G1期;并且可以明显提高Caspase-9的表达。狼毒大戟可能是通过将细胞周期阻滞于G0/G1期并且促进Caspase-9mRNA的表达而诱导Lewis细胞的凋亡。     

沉默survivin基因介导口腔表皮癌细胞KB及KBv200凋亡的比较研究

背景与目的:Survivin是IAPs家族的重要成员之一,研究表明可结合凋亡途径中的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9抑制其活性,引起肿瘤细胞的抗凋亡作用,尤其使肿瘤细胞耐受化疗药物诱导的凋亡,与化疗耐药密切相关。survivin在人口腔表皮癌细胞KB及其耐药株KBv200均有表达,本实验拟通过RNAi方法沉默survivin基因比较研究它介导KB和KBv200细胞的凋亡作用。方法:RT-PCR法检测细胞中survivinmRNA水平,流式细胞仪检测细胞中survivin蛋白水平,Hoechst33258荧光染色法观察细胞形态,PI染色结合流式细胞仪法检测细胞凋亡率,以及Caspase-3活性测定试剂盒检测Caspase-3的活性,MTT法测定肿瘤细胞生长情况。结果:KBv200细胞中survivinmRNA和蛋白表达量较高。转染mu6/survivin质粒后48h,KB和KBv200细胞中survivinmRNA表达抑制率分别为(61.98±8.12)%和(59.29±6.32)%,蛋白表达抑制率分别为(44.25±5.26)%和(38.76±4.31)%。转染mu6/survivin质粒后24h、48h、72h,流式细胞仪结果显示KB和KBv200细胞凋亡都明显增加,均在48h凋亡达到高峰,以KB凋亡率较高,并且Caspase-3活性也都明显增加,均在48h达到最高。同时KB细胞生长抑制率分别为(33.04±2.17)%、(56.25±3.32)%和(58.26±5.15)%,KBv200细胞生长抑制率则分别为(35.23±3.43)%、(44.90±4.12)%和(44.19±4.37)%。结论:siRNA方法能够有效沉默survivin基因,不仅能诱导KB细胞凋亡,而且能介导耐药株KBv200细胞凋亡。     

miR-125a表达对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响分析

目的 探讨microRNA-125a（miR-125a）对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测人肝癌HepG2细胞及人正常肝细胞7702中的miR-125a水平,同时采用真核表达载体pGenesil-1质粒制备过表达miR-125a的重组质粒pGenesil-miR-125a及表达随机序列的阴性对照pGenesil-NC,根据实验设计将HepG2细胞分为3组：空白对照组、阴性对照组和过表达组,其中空白对照组未进行转染,阴性对照组和过表达组分别成功转染pGenesil-NC和pGenesil-miR-125a,待3组转染24、48、72及96 h后采用qPCR法检测各组的miR-125a水平,噻唑盐比色法检测各组转染24、48、72及96 h的细胞增殖率,分别采用Hoechst染色和流式细胞术检测转染24、48 h后的凋亡指数和caspase-3活化率来评价凋亡情况,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组转染48 h后的细胞周期,同时采用免疫印迹法检测转染48 h后对凋亡相关基因（Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3）表达的影响。结果 HepG2细胞中miR-125a水平为（0.24±0.06）,低于正常肝细胞7702细胞（P<0.05）;与阴性表达组相比,过表达组转染24、48、72及96 h的miR-125a水平升高,增殖率降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与其余两组相比,过表达组转染后的凋亡指数、caspase-3活化率、G0/G1期细胞比例及Bax和Cleaved caspase-3水平均升高,S和G2/M期细胞比例及Bcl-2水平均降低,以上差异有统计学意义（P<0.05）。     

洛铂对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡作用的实验研究

目的 探讨洛铂（LBP）对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制。方法取对数生长期HepG2细胞,分别采用不同浓度LBP（0、2.5、5、10、20 μmol／L）处理48 h。普通光镜观察细胞形态学改变;MTS法检测细胞增殖,并计算半数抑制浓度（IC50）;Annexin Ⅴ-FITC／PI双染法及Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;Western blotting检测Bax、Bak、Bcl-2、Bid、Bcl-XL、Survivin及PARP-1蛋白表达。结果 随着LBP浓度的升高HepG2细胞密度减少,离巢死亡细胞数目增多;光镜下可见典型核固缩、碎裂的凋亡细胞。LBP能显著抑制HepG2细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05）;2.5、5、10、20 μmol／L的LBP作用HepG2细胞48 h后的增殖率分别为（92.11±1.79）％、（65.87±1.78）％、（51.57±0.81）％及（33.11±1.47）％; LBP作用HepG2细胞48 h的IC50为13.28 μmol／L。2.5、5、10、20 μmol／L LBP作用48 h HepG2细胞的凋亡率分别为（11.64±0.85）％、（20.99±2.21）％、（33.02±2.30）％和（40.77±1.58）％,与LBP 0 μmol／L 的（3.29±0.43）％比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。2.5、5、10、20 μmol／L LBP能够下调HepG2细胞中的Bcl-2、Mcl-1蛋白表达,上调Bax、Bid、PARP-1蛋白表达, 对Bcl-XL、Bak及Survivin蛋白表达无影响。结论 LBP能够诱导HepG2细胞凋亡、抑制细胞增殖,其可能机制与上调Bax、Bid和PARP-1蛋白以及下调Bcl-2、Mcl-1蛋白表达有关。     

竹节香附素A对HepG2细胞缺氧诱导因子-1α基因和蛋白表达的影响

目的:探讨竹节香附素A对缺氧条件下人肝癌细胞株(HepG2)细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)基因和蛋白表达的影响.方法:取体外低氧环境下HepG2细胞进行不同干预:特定浓度(10 μg/ml)竹节香附素A不同作用时间(0 h、6 h、12 h、24 h);不同浓度(0、5、10、20 μg/ml)竹节香附素A特定作用时间(24 h)处理,通过半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测HepG2细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达变化情况.结果:体外低氧环境下HepG2细胞可见HIF-1α mRNA和蛋白强表达,特定浓度(10 μg/ml)竹节香附素A可显著抑制HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平,药物作用0 h、6 h、12 h、24 h时HIF-1α mRNA 条带灰度值(A/A0)分别为0.73±0.08、0.44±0.12、0.24±0.09、0.07±0.03,差异具有统计学意义(P<0.01);HIF-1α蛋白A/A0比值分别为2.31±0.33、1.70±0.17、1.30±0.96、0.09±0.13,差异具有统计学意义(P<0.01).不同浓度竹节香附素A特定作用时间(24 h)处理可显著抑制HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平,药物浓度0、5、10、20 μg/ml处理,HIF-1α mRNA A/A0比值分别为0.65±0.07、0.43±0.08、0.19±0.03、0.08±0.02,差异具有统计学意义(P<0.01);HIF-1α蛋白A/A0比值分别为0.84±0.08、0.39±0.06、0.28±0.04、0.08±0.03,差异具有统计学意义(P<0.01).结论:竹节香附素A对缺氧条件下肝癌HepG2细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达具有抑制作用,并存在时间-剂量依赖性效应.