YC-1对人低氧HepG-2细胞系内HIF-1稳定性及其促靶基因转录活性抑制效应的观察

目的:观察3-(5'-羟甲基-2'-呋喃)-1-苄基吲唑(YC-1)对低氧肝癌HepG-2细胞系缺氧诱导因子-1(HIF-1)稳定性和其促靶基因转录活性的调节作用,以及对细胞增殖活性的影响,探讨将HIF-1作为肿瘤治疗新靶点的可能性.方法:低氧条件下培养肝癌HepG-2细胞,应用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测不同YC-1作用浓度下HIF-1α及其靶基因mRNA和蛋白产物的表达.MTT检测YC-1时低氧HepG-2细胞恶性增殖力的影响.结果:低氧引起HIF-1α、VEGF和GPI mRNA表达显著增加,与常氧组比较差异有统计学意义,P<0.05.低氧条件下,YC-1以剂量依赖性方式抑制VEGF、GPI mRNA与蛋白表达,与对照组比较差异有统计学意义,P<0.05.低氧条件下,YC-1浓度升高不影响HIF-1α mRNA表达量,却以剂量依赖性方式抑制HIF-1α蛋白表达.低氧条件下,YC-1显著抑制HepG-2细胞生长,且呈现剂量依赖效应.结论:低氧状态下,Yc-1抑制人肝癌HepG-2细胞系内HIF-1稳定性和转录活性,且呈剂量依赖性.YC-1抑制HepG-2细胞生长,且呈现剂量依赖效应.     

缺氧时肝癌HepG2细胞HIF-1α对GLUT-1表达的影响及机制探讨

目的探讨缺氧状态下肝癌HepG2细胞中HIF-1α表达对GLUT-1的影响。方法 HepG2人肝癌细胞株,以DMEM培养基加胎牛血清培养,分为常氧对照组(21%O2),缺氧组(1%O2),常氧加吲哚美辛组,缺氧加吲哚美辛组。收获细胞后,分别行免疫荧光法检测细胞内HIF-1α的表达和核转位;Western blot检测各组的HIF-1α、GLUT-1蛋白表达;RT-PCR检测各组的GLUT-1mRNA含量。结果缺氧时HIF-1α(蛋白:68.25±11.72)和GLUT-1(mRNA:0.7424±0.1127;蛋白:70.33±12.83)在肝癌HepG2细胞中的表达增高(P<0.05);缺氧时以吲哚美辛抑制HIF-1α蛋白(36.34±9.50)稳定和积聚后,GLUT-1 mRNA(0.3710±0.1016)及蛋白(38.46±12.20)表达受到抑制(P<0.05)。结论缺氧可以上调HIF-1α和GLUT-1在肝癌HepG2细胞中的表达;HIF-1α可以调控其下游靶基因GLUT-1的转录和表达,影响糖酵解和细胞能量的产生。     

低氧下丹参酮ⅡA对人胃癌SGC7901细胞HIF-1α与c-Met表达的影响

目的 观察低氧下丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对人胃癌SGC7901细胞c-Met蛋白表达的影响及其与低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的关系.方法 用氯化钴(CoCl2)创建低氧模型,设常氧对照组、低氧对照组和低氧加不同浓度Tan ⅡA组.分别取0.5、2.0、10.0mg/L Tan ⅡA干预低氧胃癌细胞48 h后,免疫细胞化学二步法检测HIF-1α和c-Met蛋白表达的变化.结果 免疫细胞化学法显示,TanⅡA呈剂量依赖性地抑制低氧诱导的HIF-1α和c-Met蛋白表达,且二者呈高度正相关(n=4,r=0.996,P<0.01).结论 低氧条件下,Tan ⅡA可能通过抑制HIF-1α的表达进而抑制c-Met蛋白的表达,提示Tan ⅡA可能对防治低氧导致的肿瘤侵袭转移具有重要作用.     

低氧影响卵巢癌细胞对泰素的敏感性及其机制

目的研究低氧、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对卵巢癌细胞多药耐药基因(mdr-1)及其编码P-糖蛋白(P-gp)表达的调控,探讨低氧影响卵巢癌细胞对泰素的敏感性及其机制。方法对常氧(21%O2)和低氧(1%O2、5%O2)培养的A2780细胞,应用免疫细胞化学、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)和四氮唑蓝(MTT)法等,检测HIF-1αmRNA、蛋白以及mdr-1、P-gp的表达水平和对泰素的敏感性。利用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对HIF-1α的短发夹状干扰RNA真核表达载体pSiHIF-1α,并转染A2780细胞,检测转染后HIF-1α的基因沉默效果、对mdr-1和P-gp表达的影响及其对泰素敏感性的改变。结果低氧能显著诱导A2780细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达水平的上调,HIF-1αmRNA的表达水平与低氧浓度无关,而HIF-1α蛋白表达呈低氧浓度依赖性;低氧能诱导A2780细胞的表达上调,且呈低氧浓度依赖性;低氧A2780细胞对泰素的敏感性较常氧明显降低(P<0.05)。pSiHIF-1α转染后,低氧A2780细胞能显著下调HIF-1α的表达,明显抑制mdr-1和P-gp的表达,其对泰素的敏感性显著增加。结论低氧能降低A2780细胞对泰素的敏感性,其机制可能是通过HIF-1α调控mdr-1和P-gp的表达而实现的。     

竹节香附素A对HepG2细胞缺氧诱导因子-1α基因和蛋白表达的影响

目的:探讨竹节香附素A对缺氧条件下人肝癌细胞株(HepG2)细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)基因和蛋白表达的影响.方法:取体外低氧环境下HepG2细胞进行不同干预:特定浓度(10 μg/ml)竹节香附素A不同作用时间(0 h、6 h、12 h、24 h);不同浓度(0、5、10、20 μg/ml)竹节香附素A特定作用时间(24 h)处理,通过半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测HepG2细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达变化情况.结果:体外低氧环境下HepG2细胞可见HIF-1α mRNA和蛋白强表达,特定浓度(10 μg/ml)竹节香附素A可显著抑制HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平,药物作用0 h、6 h、12 h、24 h时HIF-1α mRNA 条带灰度值(A/A0)分别为0.73±0.08、0.44±0.12、0.24±0.09、0.07±0.03,差异具有统计学意义(P<0.01);HIF-1α蛋白A/A0比值分别为2.31±0.33、1.70±0.17、1.30±0.96、0.09±0.13,差异具有统计学意义(P<0.01).不同浓度竹节香附素A特定作用时间(24 h)处理可显著抑制HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平,药物浓度0、5、10、20 μg/ml处理,HIF-1α mRNA A/A0比值分别为0.65±0.07、0.43±0.08、0.19±0.03、0.08±0.02,差异具有统计学意义(P<0.01);HIF-1α蛋白A/A0比值分别为0.84±0.08、0.39±0.06、0.28±0.04、0.08±0.03,差异具有统计学意义(P<0.01).结论:竹节香附素A对缺氧条件下肝癌HepG2细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达具有抑制作用,并存在时间-剂量依赖性效应.     

RNA干扰HIF-1α对低氧状态下食管鳞癌Eca109细胞放射敏感性的影响

目的:观察低氧状态下食管鳞癌Eca109细胞中低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达,探讨HIF-1α对Eca109细胞放射敏感性的影响及其可能的分子机制。方法:以常氧组为对照。氯化钴(cobalt chloride,CoCl_2)模拟肿瘤低氧微环境,用RT-PCR检测体外低氧状态下Eca109细胞中HIF-1α和EGFR mRNA表达水平,免疫细胞化学法检测HIF-1α和EGFR蛋白表达水平。Western blot检测RNAi沉默HIF-1α对EGFR蛋白表达的影响、采用流式细胞术检测HIF-1α沉默后,Eca109细胞经放射线照射后的凋亡情况,评价其放射敏感性的变化。结果:与常氧组比较,低氧状态下,Eca109细胞中HIF-1αmRNA表达无明显变化(P0.05),HIF-1α蛋白表达增加。EGFR mRNA表达明显升高(P0.05),EGFR蛋白表达也相应增加。与未转染组和对照组比较,siRNA转染Eca109细胞可有效沉默HIF-1α蛋白在低氧状态下的表达(P0.05),EGFR蛋白的表达水平也明显下调(P0.05)。Eca109细胞在低氧状态下放射敏感性较常氧下明显降低(P0.05)。RNAi沉默HIF-1α可部分逆转低氧造成的Eca109细胞的放射耐受。结论:低氧可上调食管鳞癌Eca109细胞HIF-1α蛋白水平;HIF-1α增加Eca109细胞在低氧状态下的放射抗性,可能与HIF-1α上调EGFR mRNA及蛋白表达有关,有效抑制HIF-1α可增加Eca109细胞的放射敏感性。     

缺氧诱导对人结肠癌SW480细胞增殖和缺氧诱导因子-1α、血红素氧合酶-1基因表达的影响

目的构建缺氧诱导模型和观察缺氧对人结肠癌SW480细胞系生长和缺氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1alpha,HIF-1α),血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)表达的影响。方法利用氯化钴(cobaltchloride,CoCl2)构建缺氧诱导模型,以MTT试验观察不同程度缺氧条件对SW480细胞生长曲线的影响;利用RT-PCR方法测定氯化钴缺氧诱导与SW480细胞HIF-1α和HO-1基因mRNA表达的时效和量效关系。结果适度缺氧(CoCl2浓度<200μmol/L)可刺激肿瘤细胞增殖,过度缺氧(CoCl2浓度>250μmol/L)则抑制其生长;HIF-1α、HO-1基因mRNA表达与氯化钴缺氧呈明显的量效关系和时效关系;HIF-1α与HO-1基因mRNA的表达在缺氧诱导量效关系(相关系数r=0.786,P<0.05)和时效关系(相关系数r=0.863,P<0.05)中均存在显著的正相关性。结论缺氧可以刺激SW480细胞增殖;HIF-1α和HO-1基因的表达与肿瘤缺氧程度密切相关;HO-1的适量表达对缺氧细胞具有细胞保护作用,其过度表达可能导致细胞损伤和凋亡。     

低氧条件下人参皂甙Rg3诱导人喉鳞癌细胞凋亡及对HIF-1α和VEGF表达的影响

 目的研究人参皂甙Rg3对低氧条件下人喉鳞癌细胞(Hep-2)生长抑制作用以及可能的机制。方法通过体外低氧培养Hep-2人喉鳞癌细胞株,同时设立阴性对照组,阳性对照组(顺铂);采用TUNEL法(终末脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记)检测细胞凋亡情况,计数凋亡细胞,计算凋亡率;流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡情况;应用免疫细胞化学技术和流式细胞技术检测Hep-2细胞在人参皂甙Rg3作用下HIF-1α和VEGF蛋白表达的变化;应用RT-PCR技术检测HIF-1α和VEGF mRNA表达的变化。结果TUNEL及流式细胞术检测Rg3组的凋亡率明显高于阴性对照组(P<0.05);在低氧条件下,Rg3组和顺铂对照组的Hep-2细胞中的HIF-1α和VEGF蛋白表达低于阴性对照组(P<0.05);Rg3组的HIF-1α和VEGF mRNA水平明显低于阴性对照组(P<0.05),顺铂组的HIF-1α和VEGF mRNA水平无明显变化。结论低氧条件下,人参皂甙Rg3诱导细胞凋亡,抑制了Hep-2细胞中的HIF-1α和VEGF蛋白和mRNA的表达,这可能是Rg3抗肿瘤作用的机制之一。     

不同氧浓度下Notch1-4受体亚型在肺腺癌细胞A549中的表达与机制

目的探讨不同氧浓度下Notch1-4受体亚型在肺腺癌细胞A549中的表达及其机制。方法分别在正常氧浓度和低氧条件下培养肺腺癌A549细胞,采用Western blotting及RT-PCR方法分别检测Notch1-4、HIF-1α蛋白和mRNA表达。结果 Notch1-4受体各亚型在A549细胞中均有表达,Notch1蛋白在低氧浓度较正常氧浓度下表达偏高,差异有统计学意义(P <0. 05)。Notch2、3和4蛋白在不同氧浓度下表达比较,差异均无统计学意义(P> 0. 05)。Notch1-4受体各亚型在A549细胞中均有表达,Notch1 mRNA在低氧浓度较正常氧浓度表达偏高(P <0. 05),Notch2、3和4 mRNA不同氧浓度下表达比较,差异均无统计学意义(P> 0. 05)。HIF-1αmRNA及蛋白在1%O2及21%O2环境下在A549细胞中均有表达,且在低氧浓度较正常氧浓度下表达偏高,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论低氧条件下,Notch1和HIF-1α在A549细胞中高表达,HIF-1α可能通过调节Notch1参与肺腺癌增殖。     

低氧条件下HIF-1α对HGF表达影响的观察

目的:探讨在体外缺氧环境下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对肝细胞生长因子(HGF)的影响.方法:选择人前列腺癌LNCaP细胞为研究对象,对其进行低氧培养,以常氧培养为对照,在HIF-1α抑制剂YC-1作用后,检测培养液上清HGF的水平.在低氧培养条件下,应用YC-1抑制HIF-1α表达后,观察低氧对HGF水平的影响,并进行比较.结果:人前列腺癌LNCaP细胞在低氧条件下HGF的表达水平为(465.37±59.61) ρg/mL,显著高于常氧培养(240.52±47.52) ρg/mL,P＜0.01.在低氧培养条件下,应用YC-1抑制HGF表达后,HGF表达水平为(438.62±61.93) ρg/mL,未见明显变化,P＞0.05.结论:低氧条件下,人前列腺癌细胞LNCaP细胞HGF表达上调可能不受HIF-1α的影响.因此,在低氧条件下,可能存在其他调节通路影响HGF表达.     

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002对人胶质瘤U251细胞中HIF-1α表达和细胞生长的影响

目的:探讨低氧环境下磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositide3kinase,PI3K)抑制剂LY294002对人胶质瘤U251细胞中PI3K/丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)信号通路下游缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)mRNA和蛋白的表达以及细胞生长、细胞凋亡、细胞黏附和侵袭能力的影响。方法:应用LY294002作用于低氧环境中的人胶质瘤U251细胞(低氧+LY294002组),以低氧环境中未加LY294002的细胞作为对照(低氧组)。CCK-8试剂盒检测U251细胞生长,FCM检测细胞凋亡百分比,黏附实验检测细胞黏附能力,侵袭实验检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法检测p-Akt蛋白的表达,RT-PCR和蛋白质印迹法检测HIF-1αmRNA及蛋白的表达。结果:LY294002能明显抑制p-Akt蛋白以及HIF-1αmRNA和蛋白的表达,与低氧组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。LY294002能抑制低氧环境中U251细胞的增殖,抑制效果在药物作用后第2～6天时最为明显(P<0.05)。低氧+LY294002组中细胞凋亡百分比明显高于低氧组(P<0.01),而细胞黏附和侵袭能力明显低于低氧组(P<0.01)。结论:LY294002能抑制低氧环境中PI3K/Akt信号通路下游HIF-1αmRNA及蛋白的表达,抑制人胶质瘤U251细胞的生长,促进细胞凋亡,并抑制细胞黏附和侵袭能力。     

缺氧及HIF-1α对结直肠癌上皮-间质转化及侵袭增殖的影响

目的 研究不同缺氧条件下缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、锌指转录因子Snail及上皮钙黏蛋白(E-cadherin)在结直肠癌SW480细胞中的表达水平,以及它们对细胞的增殖凋亡和侵袭迁移力的影响,探讨三者在结直肠癌的缺氧及上皮间质转化中的作用及可能机制.方法 利用氯化钴(CoCl2)化学诱导细胞缺氧模型,实验分组:常氧组、低氧组和无氧组.采用MTT法检测结直肠癌SW480细胞的生长增殖活性,体外侵袭实验(Transwell小室法)检测细胞的侵袭迁移力,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡及周期变化,RT-PCR及Western blot检测细胞中HIF-1α、Snail及E-cadherin mRNA与蛋白的表达.结果 MTT结果显示随CoCl2浓度的增加结直肠癌SW480细胞的增殖活性逐渐增加(P＜0.05);Transwell结果显示随缺氧程度的增加穿过基质膜和聚碳酸酯膜的细胞数逐渐增多,侵袭迁移率增加(P＜0.05);FCM检测结果显示与常氧组比较,无氧组和低氧组G0/G1期SW480细胞明显减少,G2/S期细胞明显增多,细胞凋亡率降低(P＜0.05);RT-PCR与Western blot检测结果显示低氧组、无氧组与常氧组比较,SW480细胞内HIF-1α和Snail mRNA与蛋白的表达增加,E-cadherin mRNA和蛋白的表达降低(P＜0.05),且HIF 1 α和Snail的表达呈显著正相关.HIF-1α、Snail与E-cadherin的表达均呈显著负相关(P＜0.05).结论 缺氧及HIF-1α可促进结直肠癌SW480细胞株的体外生长增殖活性,抑制其凋亡,增强其体外侵袭迁移能力,其机制可能是缺氧诱导HIF-1α表达上调直接作用于SW480细胞产生,亦可能是缺氧或HIF-1α表达上调通过促进Snail表达,抑制E-cadherin表达,间接导致EMT的发生发展而产生.     

HIF-1α对人肝癌 HepG2 细胞生长的影响

目的研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人肝癌细胞株HepG2体内生长的影响,并探讨其可能机制.方法将HIF-1α转入人肝癌细胞HepG2中,建立人肝癌裸鼠模型,观察其生长.切除瘤灶、称瘤重.标本用免疫组化和western-blot检测HIF-1α和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果HepG2细胞对HIF-1α敏感,细胞生长速度加快.结论 HIF-1α体内可促进肝癌HepG2的生长,其机制可能与其促血管生成有关.     

siRNA 沉默HIF-1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响

 目的 观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF-1α和VEGF的表达，探讨HIF-1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，RT-PCR、免疫组化法和免疫印迹法分别检测缺氧状态下HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF-1α沉默效果。结果 低氧条件下，EC9706细胞HIF-1amRNA水平稳定，蛋白表达显著升高，而VEGFmRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF-1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论 缺氧促使EC9706细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。     

HIF-1α和HIF-2α在肝癌细胞中的时相差异表达

背景与目的:缺氧诱导因子2α(hypoxia inducible factor-2 alpha, HIF-2α)与缺氧诱导因子1α结构功能相似却不可相互替代;两者在缺氧过程中的表达不一致.本研究旨在检测缺氧状态下肝癌细胞中HIF-2α和HIF-1α的时相表达差异并探讨其可能的调节机制和意义.方法:以1%低氧培养箱模拟细胞低氧环境,检测人肝癌SMMC- 7721细胞中HIF-1α和HIF-2α mRNA量和蛋白量,以及反义HIF-1α(natural antisense hypoxia inducible factor-1α,aHIF)的mRNA量.同时应用氯化钴(CoCl2)和转录抑制剂5,6-二氯苯并咪唑1-beta-D-呋喃核糖苷(5,6-dichlorobenzimida- zole-1-beta-d- ribo furanoside,DRB)检测HIF-1α和HIF-2α mRNA的半衰期,评价HIF-1α和HIF-2α mRNA的稳定性.结果:急性缺氧迅速诱导HIF-1α和HIF-2α蛋白在细胞内堆积.随着缺氧时间延长HIF-1α mRNA的稳定性下降,其蛋白表达降低,而HIF-2α和aHIF蛋白表达持续增高.结论:HIF-2α可能在肿瘤的放疗和化疗抗性以及与肿瘤侵袭和转移方面起着重要作用.aHIF参与了HIF-1α mRNA的调节.     

低氧下丹参酮ⅡA对人胃癌SGC7901细胞HIF—1α与c—Met表达的影响

目的观察低氧下丹参酮ⅡA（Tan ⅡA）对人胃癌SGC7901细胞c—Met蛋白表达的影响及其与低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达的关系。方法用氯化钴（CoCl2）创建低氧模型,设常氧对照组、低氧对照组和低氧加不同浓度Tan ⅡA组。分别取0．5、2．0、10．0mg／L Tan ⅡA干预低氧胃癌细胞48h后,免疫细胞化学二步法检测HIF-1α和c-Met蛋白表达的变化。结果免疫细胞化学法显示,TanⅡA呈剂量依赖性地抑制低氧诱导的HIF-1α和c-Met蛋白表达,且二者呈高度正相关（n=4,r=0．996,P〈0．01）。结论低氧条件下,TanⅡA可能通过抑制HIF-1α的表达进而抑制c-Met蛋白的表达,提示TanⅡA可能对防治低氧导致的肿瘤侵袭转移具有萤要作用。     

siRNA沉默HIF-2α对缺氧培养的BGC-823胃癌细胞中VEGF表达的影响

目的:观察乏氧培养条件下胃腺癌细胞系BGC-823中HIF-2α和VEGF的表达,探讨HIF-2α在低氧条件下对胃癌血管生成的调控作用.方法:采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot法分别检测低氧状态下HIF-2α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达.进一步采用化学合成小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)转染BGC-823细胞.观察转染后HIF-2 α沉默效果.结果:与常氧时比较,缺氧后BGC-823细胞HIF-2α、VEGF的mRNA水平稳定,而蛋白的表达水平均明显升高(P＜0.05),siRNA转染BGC-823后能够显著下调HIF-2α的基因表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制.结论:缺氧可促使BGC-823细胞HIF-2α在蛋白水平表达升高,并通过激活VEGF的机制调控胃癌血管生成,切断HIF-2α途径可能会有效阻止胃癌血管生成.