北极苹果结构特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立

目的为实现转基因北极苹果(Arctic~(TM) apple)目的标识管理,建立特异性实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法针对转基因北极苹果特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因北极苹果实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因北极苹果实时荧光PCR特异性强,定量检测限为20拷贝,扩增效率为96%,检测重复性良好。结论建立的特异性实时荧光PCR法可应用于转基因北极苹果的鉴定。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

实时荧光PCR技术快速检测莲蓉制品中芸豆成分

目的:建立基于实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测莲蓉制品中芸豆成分的方法。方法:以芸豆pvsbe2基因高度保守区域设计特异性引物和探针,通过对莲子及其他富含淀粉类植物DNA进行扩增,以验证方法的特异性;以1 ng/μL的芸豆DNA进行系列稀释,确定此法检测灵敏度;对含有1%芸豆与莲子的混合样品的DNA模板进行10倍梯度稀释,确定重量检测灵敏度;并应用此方法和PCR方法对市场样品进行了检测,对建立的荧光PCR方法进行验证。结果:该检测方法具有高度特异性,与莲子及其他高淀粉植物无交叉反应;DNA质量浓度的检测灵敏度达到1 pg/μL,重量检测灵敏度可达0.01%。含芸豆成分的莲蓉月饼扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:本研究建立的实时荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便的特点,更适合莲蓉制品中芸豆成分的快速检测。     

四重实时荧光PCR快速检测转基因玉米及其加工产品

本研究运用四重实时荧光聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction,PCR）对转基因玉米及其深加工制品进行筛选检测。选定花椰菜花叶病毒35S启动子（pCaMV35S）、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（tNOS）以及根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）为外源基因,选定编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2 (zSSIIb) 基因作为玉米物种的内参照基因。设计和合成靶标基因特异性引物和多重荧光探针,经特异性、重复性、灵敏性和适用性等方法学验证建立了四重实时荧光PCR检测方法。结果表明该方法检测特异性强,重复性好,扩增效率在90%~110%,标准曲线相关系数R2≥0.99,最低检测限为每20 μL反应13个拷贝,最低定量限为每20 μL反应1.3个拷贝,其检测结果与SN/T 1204-2016标准方法检测结果一致,由于四个目标基因可以在一个反应管中进行扩增反应,且含有内源基因和外源基因,可降低试剂成本,简化操作程序,缩短检测时间,为玉米及其深加工产品转基因成分的快速检测提供参考。     

转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

目的实现转基因鲑鱼AquAdvantage的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法针对转基因鲑鱼的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因鲑鱼实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因鲑鱼实时荧光PCR方法特异性强,在600 000~60拷贝范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为y=-3.2194x+40.805,R~2=0.997,检测限为60拷贝,检测重复性良好。结论建立的品系特异性实时荧光PCR方法可应用于转基因鲑鱼AquAdvantage的鉴定。     

基于微滴式和芯片式数字PCR技术的转基因克螟稻成分的定量检测

以转基因克螟稻品系为研究对象,通过大米内源蔗糖磷酸合成酶基因和转基因克螟稻品系特异性序列的绝对拷贝数分析,建立转基因克螟稻成分的双重数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）定量分析方法。本研究中转基因克螟稻定量体系中最适DNA添加量在10 pg～13 ng之间,模板断裂程度、PCR扩增退火温度等因素对定量结果的影响不大。其定量的绝对灵敏度达1 copies/μL,可在微滴式和芯片式数字PCR平台上准确检测质量分数在0.1%～100%之间的转基因克螟稻成分,尤其是对低于1%的样品,其定量准确性高于传统的实时荧光PCR方法。本研究建立的转基因克螟稻成分定量分析方法适用性较好,可用于转基因水稻规范化与标准化的定量分析。     

转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立

目的 为实现转基因甜菜GTSB77的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法 针对GTSB77的3′端外源插入片段与甜菜基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立GTSB77品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果 建立的GTSB77检测方法特异性强,定量限(LOQ)为16拷贝,扩增效率为102%,重复性测试结果相对标准偏差(RSD)介于0.21%～1.66%之间。结论 建立的实时荧光PCR方法可应用于GTSB77的鉴定检测。     

Fapas大豆粉中转基因成分检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检验人员的检验水平,扩大实验室影响力,增强竞争力。方法根据Fapas组织方提供的能力验证作业指导书及GB/T19495.4-2004《转基因产品检测核酸定性PCR检测方法》和SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》对一份100%大豆粉测试样品进行转基因成分检测。结果该批次大豆粉样品pCaMV35S、tNOS、Roundup Ready(GTS-40-3-2)品系检出转基因成分, MON89788品系未检出转基因成分。结论本次能力验证结果为满意。     

转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性实时荧光(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测方法。方法利用Taq Man实时荧光PCR(real-time PCR)技术,根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段P-e FMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为15 pg,相当于9拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA,重复性试验显示,其标准偏差(Standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均在可接受范围内。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。     

转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法的建立

为实现转基因大豆MON89788的标识管理,针对转基因大豆MON89788的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因大豆MON89788实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果显示：建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法能扩增出127 bp的产物,特异性强,灵敏度达到0.1%,约为40 个单倍体基因组拷贝,检测重复性好,可成功应用于实际样品检测。因此,建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法可以应用于转基因大豆MON89788大豆及其制品的检测。     

烘焙食品中转基因成分定性检测的FAPAS能力验证结果与分析

目的分析参加FAPAS烘焙食品中转基因成分定性检测能力验证的结果。方法根据FAPAS组织方提供的能力验证作业指导书、国家标准GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法(部分步骤改进)和行业标准SN/T1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》对一份烘焙食品测试样品进行转基因成分定性检测。结果该样品检出pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2和MON863品系(基因),未检出Bt11、Bt176、GA21、MIR604、MON810、MON88017、MON89034、MON89788、NK603和TC1507品系。结论本实验重点对核酸提取方法进行改进并严格质控,满足了烘焙食品这类加工样品转基因定性检测要求,获得能力验证结果为满意。     

Validation and collaborative study of a P35S and T-nos duplex real-time PCR screening method to detect genetically modified organisms in food products

In this work the intra and inter-laboratory validation of a duplex real-time PCR screening method for the detection of genetically modified (gm) plants is described. Target DNA sequences from Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter (P35S) and nos-terminator from Agrobacterium tumefaciens (T-nos) are amplified. The duplex real-time PCR method is using primer and probe sequences that have already been published for the individual (“single”) detection of both target sequences. The validation showed sensitivity comparable to the single PCR standard methods. In addition, combined with a reference gene and using reference standard material, the method can be used to semiquantitatively estimate the amount of gm plants in an unknown sample.     

Development of 10 new screening PCR assays for GMO detection targeting promoters (pFMV, pNOS, pSSuAra, pTA29, pUbi, pRice actin) and terminators (t35S, tE9, tOCS, tg7)

p35S promoter and tNOS terminator are the two primary targets for genetically modified organism (GMO) screening. An increasing number of genetic constructions do not contain p35S and tNOS elements; therefore, new screening assays are required. The use of a larger number of screening methods provides a better coverage of the EU-unapproved GMOs and is a cost-effective approach due to the decrease of tests required for identification. In the present study, new real-time PCR screening assays were developed targeting 10 promoter and terminator elements used in genetically modified constructs: pFMV, pNOS, pSSuAra, pTa29, pUbi, pRice actin, t35S, tE9, tOCS, and tg7. Specificity was verified against different plant species, and the limit of detection was determined on plasmid and genomic reference materials. Criteria of performance were successfully tested taking into account the recommendations of international guidelines. It means that these assays can be considered as ready for an inter-laboratory validation.     

转基因大豆及其制品二重荧光定量PCR的建立与验证

研究选用花椰菜花叶病毒35S启动子(P-35S)和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(T-NOS)为靶标基因,运用多重实时荧光PCR技术对转基因大豆及其制品进行快速筛选检测。实验通过样品核酸提取与质控,多重引物及荧光探针的设计与筛选,反应条件和反应体系的对比优化,摸索出二重荧光定量PCR检测的最佳反应体系。同时通过特异性、重复性、灵敏性和适用性实验验证,确保了该方法在同时检测2个靶标基因时,无荧光信号的相互干扰,不会出现假阴性和假阳性结果。结果表明,方法特异性高,可同时筛查两个靶标基因,扩增效率在90%~110%之间,标准曲线决定系数R2>0.98,确定了最低检测限为2拷贝/μL。开发和建立的二重荧光定量PCR检测技术可以实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进食品进出口提供技术保障。     

三重real-time PCR同步检测黄牛、水牛和牦牛成分

为准确快速地鉴定黄牛、水牛和牦牛的成分,研发具有这3 种牛特异性的引物和探针,并建立单重、双重和三重实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）方法,同步检测上述3 种牛的成分。单重real-time PCR检测时,3 种牛的检测灵敏度均为0.025 ng/μL;双重real-time PCR检测时,两两组合的引物探针含量比例为1∶1时,黄牛的检测灵敏度降低至0.1 ng/μL,而水牛和牦牛仍为0.025 ng/μL;对三重real-time PCR检测体系进行优化,当黄牛、水牛和牦牛3 组引物探针的含量比例为3∶3∶2时,检测灵敏度最佳,黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1 ng/μL,而牦牛的灵敏度仍可达到0.025 ng/μL。但上述双重和三重real-time PCR检测的灵敏度,是建立在3 种牛的含量比例为1∶1∶1的情况下,若3 种牛的比例差异较大,特别是黄牛和牦牛的含量比例差异较大时,如比例为9∶1时,含量低的成分会存在漏检。因此,在对整块肉的样品进行检测时,可采用三重real-time PCR的方法同步检测3 种牛的成分;若样品可能为上述3 种肉的为混合物,如肉糜、肉松等,则建议采用单重real-time PCR检测。     

转基因植物Real-time PCR方法检出限和定量限的研究

目前Real-timePCR(Rt-PCR)方法在转基因植物定量检测中应用最为广泛。有关该方法的检出限和定量限的计算并没有达成统一。本文采用统计模型对三种转基因植物进行实时荧光定量PCR方法检出限和定量限的研究。实验结果表明:转基因玉米NK603检出限5拷贝,定量限14拷贝;转基因棉花Mon15985检出限5拷贝,定量限12拷贝;转基因油菜Oxy235检出限4拷贝,定量限9拷贝。是利用统计学方法对转基因植物荧光定量PCR方法检出限和定量限研究的一个积极尝试,可用于其他转基因植物检测中检出限和定量限的确定。     

应用LNA-TaqMan探针实时荧光PCR检测大米制品中转基因成分

大米制品中痕量转基因成分的检测需要特异和超灵敏的检测方法。本研究以行业标准中转基因大米筛查位点CaMV35S启动子、NOS终止子和Cry1A基因为目标,利用在常规TaqMan探针中掺入锁核苷酸提高探针退火温度和杂交特异性等特点,经比较以上位点不同LNA-TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测效果,建立了针对上述筛查位点的基于LNA-TaqMan探针的新型实时荧光PCR检测方法。该方法特异性强,检测灵敏度超高;与普通TaqMan实时荧光PCR方法相比,其反应Ct值可提前1～3 个循环（Cry1A位点除外）,检测低限可达3 pg。该检测方法可以用以检测大米制品中常规实时荧光PCR难以检测到的痕量转基因大米成分。